Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi
Summary
Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.
Abstract
Tümörilişkili makrofajlar (TAM) tümör büyümesi, invazyon, metastaz ve kanser tedavilerine karşı direnç için önemli bir bileşen olarak tanımlanmıştır. Ancak, tümör ilişkili makrofajlar tümör mikroçevrebağlı olarak tümör için zararlı olabilir ve geri ya bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesi niantüre veya anti-tümör yanıtı artırarak onların fenotipik özelliklerini değiştirebilir. Makrofajların moleküler eylemleri ve tümör hücreleriyle etkileşimleri (örn. fagosittoz) kapsamlı olarak incelenmemiştir. Bu nedenle, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim (M1/M2-subtype TAM) ve tümör mikroortamında kanser hücreleri arasındaki etkileşim artık kanser immünoterapi araştırmalarının odak noktasıdır. Bu çalışmada, faz kontrastı, floresan ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanılarak makrofajların fagositik aktivitesini değerlendirmek için indüklenen M1 makrofajlar ve fare meme 4T1 karsinom hücrelerinin canlı hücre kokültür modeli geliştirilmiştir. Bu yöntem fagositözün çok noktalı canlı hücre görüntülemesini gözlemleyebilir ve belgeleyebilir. 4T1 hücrelerinin M1 makrofajları ile fagosittozisi, karboksifluorescein succinimidyl ester (CFSE) ile 4T1 hücrelerini boyamadan önce floresan mikroskopi ile görülebilir. Mevcut yayın, makrofajları ve tümör hücrelerini tek bir görüntüleme kabında nasıl birarada hale getirmek, M1 makrofajları polarize etmek ve 13 saat boyunca 4T1 hücresini içine alan makrofajların çok noktalı olaylarını kaydetmeyi açıklamaktadır.
Introduction
Makrofajlar bağışıklık savunmasının ilk hattıdır ve kanser hücreleri de dahil olmak üzere patojenlere ve yabancı maddelere karşı bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde rol oynarlar. Onlar yok eder ve vücutta istenmeyen parçacıklar kurtulur özel bir fagosit vardır. Makrofajlar apoptotik hücrelerin ve mikroorganizmaların temizlenmesi ve diğer bağışıklık hücrelerinin işe alınması gibi savunma fonksiyonları katkıda1. Makrofajlar, çevresel sinyallere yanıt olarak M1 ve M2 makrofajları olmak üzere iki farklı tipe ayırabilir2. M1-polarize makrofajlar (yani, klasik olarak aktive makrofajlar) sitokin interferon-γ (IFN-γ) ve lipopolisakkaritler (LPS) tarafından aktive edilir ve inflamatuar yanıt, patojen açıklık, etkin fagositoz ve tümörial bağışıklık3,4katılır. M2 makrofajlar yakından tümör ilişkili makrofajlar ile ilgili (TAMs) ve anti-inflamatuar ve tümör promosyonözellikleri4 var.
Fagositoz, Antik Yunanca ‘dan türetilmiştir (fajin), anlamı “yutmak”, (kytos), anlamı “hücre”, ve -osis, anlamı “süreç”5. Fagosittoz, fagositlerin (makrofajlar, monositler ve nötrofiller dahil) istilacı patojenleri öldürüp yuttuğu, yabancı parçacıkları temizlediği ve apoptotik hücre enkazlarını temizlediği reseptör aracılı bir süreçtir. Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) meme kanseri de dahil olmak üzere farklı tümörlerde stroma bulunur, ve pro-tümör fonksiyonları var6,7, fagosityolis direnç ile sonuçlanan. Makrofajlar ile tümör hücrefagositozunun detaylı mekanizması henüz anlaşılamamıştır.
Bu çalışmada iki aşamalı bir yöntem ortaya konmaktadır: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar birlikte kültürlenmiş, ve 2) makrofajların fagositik aktivitesi canlı hücreli video mikroskopisi kullanılarak değerlendirilmektedir. CFSE floresan boya 4T1 fare meme karsinom hücreleri leke kullanılmıştır. Leke etiketler 4T1 hücreleri tek bir görüntüleme çanak içinde cocultured M1 makrofajlar onları ayırt etmek için. RAW 264.7 makrofajlar LPS ve IFN-γ ile M1 fenotip içine polarize edilir. Tam bir polarizasyon sağlamak için FITC’ye konjuge anti-iNOS antikorile immünoleme yapıldı. Daha sonra, zaman atlamalı görüntülerin çok noktalı bir dizi eşkültür içinde, fagositoksis de dahil olmak üzere birden fazla olay gözlemlemek için elde edildi.
Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimlerin daha iyi anlaşılması potansiyel kanser immünoterapisine yol açabilir. Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı bir ortamda hücresel dinamiklerin ayrıntılı bir görünüm sunar ve hücre göçü, fenotipik tarama, apoptoz ve sitotoksisite8,9 nörobilim, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfi çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmada önerilen tümör meme kanseri olmasına rağmen, yöntem aynı zamanda birden fazla hedef hücreleri ve farklı etki hücreleri uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol iki adım gerektirir: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar coculture ve 2) zaman atlamalı mikroskopi kullanarak makrofaj fagositik aktivitenin değerlendirilmesi. Canlı hücre kokültür yaygın fagositositve göç tahlillerinde kullanılır. Canlı hücre kokültür modeli burada bir floresan boya kullanan basit, uyarlanabilir in vitro prosedürü(Şekil 2)4T1 hedefli hücreleri etiketlemek için kullanılan bir floresan boya, CFSE. Bu, canl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Finansal Geran Putra Berimpak (GBP), Üniversite Putra Malezya: 9542800 tarafından finanse edilmiştir. Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) laboratuvarları ve mikroskopi görüntüleme tesisine teşekkür ederiz. Bu çalışma için deneysel video düzenleme ve kayıt ile ilgili yardım için Mohd Daniel Hazim için özel teşekkürler.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Referenzen
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
