Слияние клеток генома Отредактированные клеточные линии для возмущения клеточной структуры и функции
Summary
Цель юаней протокола состоит в том, чтобы сплавить два различных типа клеток для создания гибридных ячеек. Флуоресценция микроскопии анализ сросшиеся клетки используется для отслеживания клетки происхождения клеточных органелл. Этот асссможно использовать для изучения того, как клеточная структура и функция реагируют на возмущение путем слияния клеток.
Abstract
В липидных мембранах жизнь пространственно разделена, чтобы позволить изолированное образование различных молекулярных состояний внутри клеток и органелл. Слияние клеток представляет собой слияние двух или более клеток для формирования одной клетки. Здесь мы предоставляем протокол для слияния клеток двух различных типов клеток. Сросые гибридные клетки обогащаются сортировкой на основе цитометрии потока, за которой следует флуоресцентная микроскопия структуры и функции гибридных клеток. Флуоресцентно помеченные белки, генерируемые при редактировании генома, образуются внутри сброшенных клеток, что позволяет идентифицировать клеточные структуры на основе выбросов флуоресценции и ссылаться на тип клеточного происхождения. Этот надежный и общий метод может быть применен к различным типам клеток или органеллам, представляющим интерес, чтобы понять клеточную структуру и функции по целому ряду фундаментальных биологических вопросов.
Introduction
Гомеостасическое поддержание клеточной структуры имеет решающее значение для жизни. Клетки имеют характерные морфологии, субклеточные числа органелл и внутренний биохимический состав. Понимание того, как эти фундаментальные свойства генерируются и как они идут наперекосяк во время болезни, требуют лабораторных инструментов, чтобы возмутить их.
Слияние клеток представляет собой слияние двух или более отдельных клеток. Слияние клеток, возможно, имеет решающее значение для появления эукариотической жизни1. В организме человека, слияние клеток является относительно редким, происходящих во время ограниченных условий развития и типов тканей, таких как во время оплодотворения или формирования мышц, костей и плаценты2. Этот протокол описывает индукцию слияние клеток в линиях клеток культуры ткани с дифференциально флуоресцентно обозначенными органеллами, как инструмент для того чтобы понять механизмы контролируя структуру и функцию клетки.
В пробирке индуцированных клеточных клеток слияния имеет центральное значение для производства моноклональных антител3, важный инструмент для биологических исследований и лечения заболеваний. Слияние клеток также было использовано, чтобы задать много различных фундаментальных клеточных биологических вопросов о доминировании клеточного цикла4, aneuploidy5,6, клеточное перепрограммирование7,8, ремонт поврежденных нейронов9, вирусное пролиферации10, апоптоз11, tumorigenesis12, цитоскелетная динамика13, и мембранного синтеза14,15. Лабораторные методы, чтобы вызвать слияние клеток16,17,18,19 индуцировать липидной мембраны объединения через физическое слияние двух двух слоев в один. Слияние клеток может быть вызвано электричеством18, вирусные методы17, термоплазмонное отопление20, трансгенное выражение19, и химических веществ, включая полиэтиленгликоль (PEG)16,21,22.
Центросомами являются микротубулы, организуя центры, контролирующие клеточную форму, подвижность, поляризацию и деление23. Центросомные корни представляют собой волокнистые структуры, простирающиеся от центросомы, содержащие белок rootletin24 (кодируется геном CROCC). Недавно мы использовали клеточные клетки слияния, чтобы понять, как центросомы положение и число меняется внутри гетерокарионов по отношению к родительским клеткам24. Обоснование использования этого метода заключается в отслеживании клетки происхождения корней в гетерокарионе после слияния дифференциально флуоресцентно отмеченных родительских клеток, и, таким образом, к изображению слиянию и делению органеллы. Флуоресцентно помеченные белки rootletin-meGFP или rootletin-mScarlet-I создаются путем редактирования генома в отдельных клеточных линиях, которые затем сливается с PEG-опосредованного синтеза клеток. Мы описываем использование клеточных красителей(Таблица материалов) для идентификации сросшиеся клетки по цитометрии потока и последующей флуоресценционной микроскопии идентификации центросомной клетки происхождения и морфологии (Рисунок 1). Этот подход является надежным и уникальным методом для изучения того, как основные изменения в клеточном состоянии, включая число органелл посягают на гомеостаз клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем поверхностный и экономичный протокол для сплавливки клеток и визуализации последующей архитектуры клеточных гибридов с помощью микроскопии, что занимает около двух дней от начала до конца. Критическими частями этого протокола являются обогащение срослых ячеек сорт?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Wellcome Trust Генри Wellcome стипендий Р.М. (https://wellcome.ac.uk/grant номер 100090/12 /). Фонднера не принимала никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим Ашока Венкитарамана и Пола Френка за критические советы и рекомендации по проекту. Мы благодарим Кьяру Коссетти и Габриэлу Грондис-Котарба в Кембриджском институте медицинских исследований Потока Цитометрии объекта за отличную поддержку. Мы благодарим Лиама Кассидея, Томаса Миллера и Джанмарко Контино за коррективы рукописи.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
Referenzen
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
