Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon
Summary
Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.
Abstract
Yaşam, hücre ve organeller içinde farklı moleküler durumların izole oluşumunu sağlamak için lipid membranları içinde mekansal olarak bölümlenir. Hücre füzyonu, tek bir hücreyi oluşturmak için iki veya daha fazla hücrenin birleşmesidir. Burada iki farklı hücre türünün hücre füzyonu için bir protokol salıyoruz. Erimiş hibrid hücreler akış sitometri tabanlı sıralama ile zenginleştirilmiş, hibrid hücre yapısı ve fonksiyonufloresan mikroskobu takip. Genom düzenleme tarafından üretilen floresan etiketli proteinler erimiş hücrelerin içinde görüntülenir, hücre yapıları floresan emisyona göre tespit ve kökeni hücre tipine geri başvurulmasını sağlar. Bu sağlam ve genel yöntem, hücresel yapıyı ve işlevi bir dizi temel biyolojik soru da anlamak için farklı hücre tiplerine veya ilgi organlarına uygulanabilir.
Introduction
Hücresel yapının homeostatik bakımı yaşam için çok önemlidir. Hücreler karakteristik morfolojilere, hücre altı organel sayılarına ve iç biyokimyasal bileşimlere sahiptir. Bu temel özelliklerin nasıl oluşturulduğunu ve hastalık sırasında nasıl ters gittiklerini anlamak, onları tedirgin etmek için laboratuvar araçları gerektirir.
Hücre füzyonu iki veya daha fazla ayrı hücrenin birleşmesidir. Hücre füzyonu ökaryotik yaşamın ortaya çıkması için kritik olabilir1. İnsan vücudunda, hücre füzyonu nispeten nadirdir, sınırlı gelişimsel durumlar ve doku tipleri sırasında meydana gelen, döllenme veya kas oluşumu sırasında gibi, kemik ve plasenta2. Bu protokol, hücre yapısını ve işlevini kontrol eden mekanizmaları anlamak için bir araç olarak, farklı floresan olarak etiketlenmiş organeller ile doku kültürü hücre hatlarında hücre-hücre füzyoninin indüksiyonunu tanımlar.
In vitro indüklenen hücre-hücre füzyonu monoklonalantikorlarınüretiminde merkezi 3 , biyolojik araştırma ve hastalık tedavisi için önemli bir araçtır. Hücre füzyonu da hücre döngüsü hakimiyeti hakkında birçok farklı temel hücre biyolojik sorular sormak için kullanılmıştır4, aneuploidy5,6, hücresel yeniden programlama7,8, hasarlı nöronlarınonarımı 9, viral proliferasyon10, apoptoz11, tümörigenesis12, sitoskeletal dinamik13, ve membran füzyon14,15. Hücre-hücre füzyonu ikna etmek için laboratuvar tabanlı yöntemler16,17,18,19 bir iki iki katmanlı fiziksel birleştirme yoluyla lipid membran birleşmesi neden. Hücre füzyonu elektrik tarafından indüklenen olabilir18, viral tabanlı yöntemler17, termoplazmaik ısıtma20, transgen ekspresyonu19, ve polietilen glikol dahil kimyasallar (PEG)16,21,22.
Centrozsomes hücresel şekil, hareketlilik, polarizasyon ve bölüm23kontrol mikrotübül organize merkezleri vardır. Centrozomal kökler,24 protein rootletini içeren centrozomlardan yayılan lifli yapılardır (CROCCgeni tarafından kodlanmıştır). Biz son zamanlarda nasıl centrosome pozisyon ve sayı ebeveyn hücreleri24göre heterokaryoniçinde değişir anlamak için hücre-hücre füzyon kullanılır. Bu yöntemin kullanımının arkasındaki mantığı farklıfloresan floresan etiketli ebeveyn hücrelerinin füzyon sonra bir heterokaryon içinde köklerin kökeni hücre izlemek için, ve böylece görüntü organel füzyon ve fizyon için. Floresan etiketli proteinler rootletin-meGFP veya rootletin-mScarlet-I, daha sonra PEG aracılı hücre füzyonu ile eritilen ayrı hücre hatlarında genom düzenleme tarafından oluşturulur. Akış sitometrisi ve daha sonraki floresan mikroskobu ile erimiş hücreleri tanımlamak için hücre boyalarının(Malzeme Tablosu)kullanımını ve daha sonra menşe ve morfolojisentrozom hücresinin tanımlanmasını tanımlarız (Şekil 1). Bu yaklaşım, hücre homeostazı üzerine organel sayısı da dahil olmak üzere hücresel devlet büyük değişiklikler nasıl incelenmesi için sağlam ve benzersiz bir yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücreleri eritmek ve hücre melezlerinin sonraki mimarisini mikroskopi ile görselleştirmek için kolay ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz, baştan sona yaklaşık iki gün sürüyor. Bu protokolün kritik bölümleri, erimiş hücrelerin hücre sıralaması (protokol bölüm 3) ile zenginleşmesi ve erimiş hücrelerin mikroskopi ile dikkatli bir şekilde doğrulanmasıdır (protokol bölümü 4). Bu bölümler, erimiş hücrelerin kolayca elde edilmesini ve iyi niyetli heterokaryonlar olmasını sağlar. K…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Wellcome Trust Henry Wellcome Bursu ile R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numarası 100090/12/Z) tarafından finanse edilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı. Ashok Venkitaraman ve Paul French’e proje hakkında eleştirel tavsiyeler ve rehberlik için teşekkür ederiz. Biz mükemmel destek için Cambridge Enstitüsü Tıbbi Araştırma Akış Cytometry tesisinde Chiara Cossetti ve Gabriela Grondys-Kotarba teşekkür ederiz. Taslağı doğruldukları için Liam Cassiday, Thomas Miller ve Gianmarco Contino’ya teşekkür ederiz.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
Referenzen
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
