Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, zwei verschiedene Zelltypen zu verschmelzen, um Hybridzellen zu erstellen. Die Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von geschmolzenen Zellen wird verwendet, um die Ursprungszelle von Zellorganellen zu verfolgen. Dieser Test kann verwendet werden, um zu erforschen, wie Zellstruktur und Funktion auf Störungen durch Zellfusion reagieren.
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Methodenartikel
Zell-Zell-Fusion des Genoms bearbeitete Zelllinien zur Störung der Zellstruktur und Funktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Leben ist räumlich in Lipidmembranen aufgeteilt, um die isolierte Bildung von unterschiedlichen molekularen Zuständen in Zellen und Organellen zu ermöglichen. Zellfusion ist die Verschmelzung von zwei oder mehr Zellen zu einer einzelnen Zelle. Hier stellen wir ein Protokoll zur Zellfusion von zwei verschiedenen Zelltypen bereit. Geschmolzene Hybridzellen werden durch strömungszytometriebasierte Sortierung angereichert, gefolgt von der Fluoreszenzmikroskopie der Hybridzellstruktur und -funktion. Fluoreszierend markierte Proteine, die durch genomische Bearbeitung erzeugt werden, werden in geschmolzenen Zellen abgebildet, so dass zelluläre Strukturen anhand der Fluoreszenzemission identifiziert und auf den Zelltyp des Ursprungs verwiesen werden können. Diese robuste und allgemeine Methode kann auf verschiedene Zelltypen oder Organellen von Interesse angewendet werden, um zelluläre Struktur und Funktion über eine Reihe von grundlegenden biologischen Fragen zu verstehen.
Einleitung
Die panostatische Erhaltung der Zellstruktur ist lebenswichtig. Zellen haben charakteristische Morphologien, subzelluläre Organellenzahlen und eine interne biochemische Zusammensetzung. Um zu verstehen, wie diese grundlegenden Eigenschaften erzeugt werden und wie sie während der Krankheit schief gehen, müssen Laborwerkzeuge sie stören.
Zellfusion ist das Zusammenführen von zwei oder mehr getrennten Zellen. Zellfusion kann entscheidend für die Entstehung von eukaryotischen Leben gewesen sein1. Im menschlichen Körper ist die Zellfusion relativ selten, die bei eingeschränkten Entwicklungsbedingungen und Gewebetypen auft....
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Protokoll
1. Differential fluoreszierende Zellkennzeichnung
- Gen-Tagging mit CRISPR Cas9
- Verwenden Sie CRISPR Cas9 Genombearbeitung, um Rootletin (oder andere Gene von Interesse) mit den fluoreszierenden Proteinen meGFP oder mScarlet-I in menschlichen Krebszelllinien zu markieren.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Genombearbeitung werden an anderer Stelle behandelt24,25,26.
- Verwenden Sie CRISPR Cas9 Genombearbeitung, um Rootletin (oder andere Gene von Interesse) mit den fluoreszierenden Proteinen meGFP oder mScarlet-I in menschlichen Krebszelllinien zu markieren.
- Fluoreszierende Farbstoffkennzeichnung
- Wachsen Sie Cal51 menschliche Krebszellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt dur....
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Ergebnisse
Entsprechend gekennzeichnete Zellen sind während der Durchflusszytometrie durch Fluoreszenzsignal sichtbar, das höher ist als unbeschriftete Kontrollzellen (Abbildung 2A). Für die Sortierung doppelt positiver Zellen werden Tore für die Sortierung doppeltpositiver Zellen gesetzt, die diese Population direkt zu bildgebenden Gerichten für weitere mikroskopische Analysen anreichern. Geschmolzene Zellen sind als ausgeprägte doppelt fluoreszierend .......
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Diskussion
Wir zeigen ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Verschmelzung von Zellen und zur Visualisierung der nachfolgenden Architektur von Zellhybriden mit Mikroskopie, das von Anfang bis Ende etwa zwei Tage dauert. Kritische Teile dieses Protokolls sind die Anreicherung von geschmolzenen Zellen durch Zellsortierung (Protokollabschnitt 3) und die sorgfältige Validierung von geschmolzenen Zellen durch Mikroskopie (Protokollabschnitt 4). Diese Abschnitte stellen sicher, dass geschmolzene Zellen leicht erhalten werden und.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einem Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship to R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Nummer 100090/12/Z) finanziert. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Ashok Venkitaraman und Paul French für die kritische Beratung und Anleitung zu dem Projekt. Wir danken Chiara Cossetti und Gabriela Grondys-Kotarba im Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Liam Cassiday, Thomas Miller und Gianmarco Contino für das Korrekturlesen des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15-ml-Röhrchen | Sarstedt | 62554502 | |
| 37%iger Formaldehydlösung | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Konfokales Laserscanning-Airyscan-Mikroskop | Carl Zeiss | ||
| 8-Well-Bildgebungsschalen | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP-Alpaka GFP-Booster Nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Zellsortierer | BD Biosciences | ||
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Zellfilter (70 μ m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fötales Rinderserum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I Alpaka-Nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-AT565 | |
| L15 CO2 unabhängiges Bildgebungsmedium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenolrotfreies DMEM, hoher Glukosegehalt | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)8 | g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O bis zu 1 l | ||
| Polyethylenglykol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylen-Röhrchen | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nichtionisches Tensid |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nichtionisches Reinigungsmittel |
Referenzen
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
