Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Présenté ici est un protocole pour la génération d’une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.
Abstract
La différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) a transformé la capacité d’étudier le développement humain à la fois aux niveaux biologique et moléculaire et a fourni des cellules pour une utilisation dans des applications régénératrices. Les approches standard pour la culture hESC utilisant la culture de type colonie pour maintenir les HESC indifférenciés et le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette pour la différenciation en différentes couches germinales sont inefficaces et prennent du temps. Présenté ici est une méthode de culture unicellulaire en utilisant hESCs au lieu d’une culture de type colonie. Cette méthode permet le maintien des caractéristiques des HESC indifférenciés, y compris l’expression de marqueurs hESC à des niveaux comparables aux HESC de type colonie. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour la génération de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de hESCs de type unicellulaire qui produit des PNJ dans un délai de 1 semaine. Ces cellules expriment fortement plusieurs gènes de marqueur de PNJ et peuvent se différencier en divers types de cellules neurales, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes. Ce système de culture unicellulaire pour les HESC sera utile pour étudier les mécanismes moléculaires de ces processus, les études de certaines maladies et les écrans de découverte de médicaments.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales primaires, qui se différencient ensuite en diverses lignées cellulaires progénitrices multipotentes. Ces lignées donnent par la suite naissance à tous les types de cellules dans le corps humain. Les systèmes de culture hESC in vitro ont transformé la capacité d’étudier le développement embryonnaire humain et ont servi d’outil précieux pour obtenir de nouvelles connaissances sur la façon dont ces processus sont réglementés aux niveaux biologique et moléculaire. De même, les études sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) générées par la reprogrammation de cellules somatiques isolées de patients humains fournissent de nouvelles informations sur diverses maladies. En outre, l’ancêtre et les cellules différenciées dérivées des HESC peuvent être utiles pour la recherche impliquant la thérapie de cellules souches et le dépistage de drogue1,2,3,4.
Les hESC peuvent être induits pour se différencier en cellules progénitrices neurales (PNJ), qui sont des cellules multipotentielles avec une capacité d’auto-renouvellement étendue. Par la suite, ces cellules peuvent être différenciées en neurones, astrocytes, et oligodendrocytes5,6. Les PNJ offrent également un système cellulaire pour les études in vitro de la biologie neurodéveloppementale et de diverses maladies neurologiques. Cependant, les méthodes actuelles de culture de type colonie impliquant les HESC et leur différenciation en PNJ sont inefficaces et impliquent souvent la coculture ainsi que le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette5,7,8,9. Ces protocoles présentent des taux de survie plus faibles et une différenciation spontanée et prennent plus de temps.
Présenté ici est un système de culture amélioré et robuste qui est facilement évolutif et utilise la culture de type unicellulaire de haute densité de hESCs10. L’inclusion de l’inhibiteur de Roh-kinase (ROCK) a contribué à l’efficacité de survie sensiblement améliorée pendant la culture de type de cellule simple de hESC10,11,12,13,14. Dans ce système de culture, les HESC peuvent être facilement entretenus et étendus. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour générer des PNJ à partir de la culture de type unicellulaire des HESC, qui permet la production de PNJ très purs. Inhibition des voies de signalisation BMP/TGMD/activine avec des inhibiteurs ALK induisent efficacement la différenciation des HCES de type unicellulaire en PNJ15,16, qui peuvent alors être induits à se différencier en lignées neuronales fonctionnelles, telles que les neurones dopaminergiques et les astrocytes.
En résumé, le protocole de culture de type unicellulaire utilisant les CSSH offre un modèle attrayant pour étudier la différenciation de ces cellules en différentes lignées, y compris les PNJ. Ce protocole est facilement évolutif et donc adapté pour générer des cellules pour la recherche impliquant la thérapie régénérative et le dépistage des médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des méthodes évolutives et efficaces pour la différenciation des HESC en diverses lignées et la génération d’un nombre suffisant de cellules différenciées sont des critères importants pour le dépistage des médicaments et la thérapie par cellules souches. Diverses méthodes de passage unicellulaire ont été publiées, dans lesquelles les cellules sont cultivées en présence d’inhibiteur syUP Ou d’autres petites molécules pour améliorer la survie, mais les produits finaux de ces méthodes de culture sont le…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Carl D. Bortner (NIEHS) pour son aide dans l’analyse du FACS. Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros de l’Institut national des sciences de la santé environnementale, les National Institutes of Health, Z01-ES-101585 à amJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
Referenzen
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Entwicklungsbiologie. 313 (1), 107-117 (2008).
