인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화
Summary
여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 시험관 내 분화는 생물학적 및 분자 수준 모두에서 인간의 발달을 연구하는 능력을 변형시키고 재생 응용 프로그램에 사용하기 위해 세포를 제공했습니다. 콜로니 형 배양을 이용한 hESC 배양에 대한 표준 접근법은 미분화 hESCs 및 배아 체(EB) 및 상이한 세균 층으로의 분화를 위한 로제트 형성을 유지하기 위해 비효율적이고 시간이 많이 소요된다. 여기서 제시된 것은 콜로니형 배양 대신 hESC를 이용한 단일 세포 배양 방법이다. 이 방법을 사용하면 콜로니 형 hESCs에 필적하는 수준에서 hESC 마커의 발현을 포함하여 미분화 hESCs의 특성 특징을 유지 보수 할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 1주일 이내에 NPC를 생산하는 단일 세포 형 hCS로부터 신경 전구 세포(NPC) 생성을 위한 효율적인 방법을 제시한다. 이 세포는 몇몇 NPC 마커 유전자를 높게 표현하고 도파민성 신경세포 및 성상세포를 포함하여 각종 신경 세포 모형으로 분화할 수 있습니다. hESCs를 위한 이 단세포 배양 시스템은 이 프로세스의 분자 기계장치, 특정 질병의 연구 및 약 발견 스크린을 조사하는 데 유용할 것입니다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 3 개의 1 차적인 세균 층으로 분화하는 잠재력을 가지고, 그 때 각종 다능성 전구 세포 계보로 분화합니다. 이 혈통은 이후에 인체에 있는 모든 세포 모형을 초래합니다. 시험관 내 hESC 배양 시스템은 인간 배아 발달을 연구하는 능력을 변화시켰으며 이러한 과정이 생물학적 및 분자 수준에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 통찰력을 얻기위한 귀중한 도구로 사용되었습니다. 유사하게, 인간 환자에서 분리된 체세포 를 재프로그래밍해서 생성된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 연구 결과는 각종 질병에 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, hESCs로부터 유래된 전구 및 분화 세포는 줄기세포 치료 및 약물스크리닝1,2,3,4와관련된 연구에 유용할 수 있다.
hESCs는 광범위한 자기 갱신 능력을 가진 다중 전위 세포인 신경 전구 세포 (NPC)로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이어서, 이들 세포는 뉴런, 성상세포 및 올리고엔드로시트5,6으로분화될 수 있다. NPC는 또한 신경 발달 생물학 및 각종 신경 질병의 시험관 내 연구를 위한 세포 시스템을 제안합니다. 그러나, 현재 의 식민지 형 배양 방법은 HCS와 NPC로의 분화를 수반하며 종종 배아체(EB) 및 로제트 형성5,7,8,9뿐만아니라 공동배양을 수반한다. 이 프로토콜은 더 낮은 생존율 및 자발적인 분화를 전시하고 더 많은 시간 소모적입니다.
여기서 제시된 개선되고 견고한 배양 시스템은 쉽게 확장 가능하고 hESCs10의고밀도 단세포 형 배양을 사용한다. 로키나아제(ROCK) 억제제의 포함은hESC10,11,12,13,14의단일 세포 형 배양 동안 생존 효율을 현저히 향상시킨에 기여했다. 이러한 문화 시스템에서 는 hESCs를 쉽게 유지 관리하고 확장할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 고도로 순수한 NPC의 생산을 허용하는 hESCs의 단일 세포 형 배양으로부터 NPC를 생성하는 효율적인 방법을 제시합니다.
요약하자면, hESCs를 이용한 단세포 형 배양 프로토콜은 NPC를 포함한 다양한 계보로 이들 세포의 분화를 연구하는 매력적인 모델을 제공한다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능하기 때문에 재생 요법 및 약물 스크리닝과 관련된 연구를 위한 세포 생성에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 계보로 hESCs를 분화하고 충분한 수의 분화 세포를 생성하기 위한 확장 가능하고 효율적인 방법은 약물 스크리닝 및 줄기 세포 치료에 중요한 기준입니다. 다양한 단세포 통과 방법이 발표되었으며, 이 때 세포는 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제 또는 다른 소분자의 존재에서 배양되지만, 이들 배양 방법의 최종 제품은 콜로니 형 hESCs17,18,</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 FACS 분석에 도움을 준 칼 D. 보트너 박사 (NIEHS)에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램, 건강의 국립 연구소, AMJ에 Z01-ES-101585에 의해 지원되었다.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
Referenzen
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