Enrichissement des tissus mammifères et des oocytes Xenopus avec du cholestérol
Summary
Deux méthodes d’enrichissement du cholestérol sont présentées : l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol pour enrichir les tissus et les cellules des mammifères, et l’utilisation de dispersions à base de phospholipides enrichies de cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Ces méthodes sont instrumentales pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans la fonction moléculaire, cellulaire, et d’organe.
Abstract
L’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules des mammifères, y compris les oocytes Xenopus utilisés pour étudier la fonction cellulaire, peut être accompli en utilisant une variété de méthodes. Ici, nous décrivons deux approches importantes utilisées à cette fin. Tout d’abord, nous décrivons comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol à l’aide d’artères cérébrales (tissus) et de neurones hippocampiques (cellules) à titre d’exemples. Cette approche peut être utilisée pour n’importe quel type de tissu, cellules ou lignées cellulaires. Une approche alternative pour l’enrichissement du cholestérol implique l’utilisation de lipoprotéines de faible densité (LDL). L’avantage de cette approche est qu’elle utilise une partie de la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule. Cependant, alors que l’approche de la cyclodextrine peut être appliquée pour enrichir n’importe quel type d’intérêt cellulaire avec le cholestérol, l’approche LDL est limitée aux cellules qui expriment les récepteurs LDL (par exemple, les cellules hépatiques, les cellules dérivées de la moelle osseuse telles que les leucocytes sanguins et les macrophages tissulaires), et le niveau d’enrichissement dépend de la concentration et de la mobilité du récepteur LDL. En outre, les particules de LDL incluent d’autres lipides, ainsi l’accouchement de cholestérol est non spécifique. Deuxièmement, nous décrivons comment enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol à l’aide d’une dispersion à base de phospholipid (c.-à-d. liposomes) qui comprend le cholestérol. Les ocytes Xenopus constituent un système d’expression hétérologue populaire utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de cyclodextrine du tissu mammifère (artères cérébrales) et pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de phospholipid des oocytes Xenopus, nous démontrons que les niveaux de cholestérol atteignent un maximum après 5 min d’incubation. Ce taux de cholestérol demeure constant pendant les périodes prolongées d’incubation (p. ex., 60 min). Ensemble, ces données fournissent la base pour des conditions temporelles optimisées pour l’enrichissement de cholestérol des tissus, des cellules, et des oocytes de Xénoopus pour des études fonctionnelles visant à interroger l’impact de l’enrichissement de cholestérol.
Introduction
Le cholestérol, un lipide cellulaire majeur, joue de nombreux rôles fonctionnels et structurels critiques1,2,3,4,5,6,7,8,9. De la régulation des propriétés physiques de la membrane plasmatique à assurer la viabilité cellulaire, la croissance, la prolifération, et servant de molécule de signalisation et de précurseur dans une pléthore de voies biochimiques, le cholestérol est un composant impératif nécessaire pour la fonction normale de cellules et d’organes. En conséquence, l’insuffisance de cholestérol a comme conséquence des malformations physiques graves et une série de désordres. D’autre part, même une petite augmentation du cholestérol au-dessus des niveaux physiologiques (2-3x) est cytotoxique1,2,10 et a été associée au développement de troubles, y compris cardio-vasculaire11,12,13 et les maladies neurodégénératives14,15,16,17. Ainsi, pour interroger les fonctions critiques du cholestérol et pour déterminer l’effet des changements dans les niveaux de cholestérol, différentes approches qui modifient la teneur en cholestérol dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus ont été développées.
Modification des taux de cholestérol dans les tissus et les cellules des mammifères
Plusieurs approches peuvent être exploitées pour diminuer les niveaux de cholestérol dans les tissus et les cellules18. Une approche implique leur exposition aux statines dissoutes dans le sérum lipoprotéine-déficiente pour inhiber la réductase de HMG-CoA, qui contrôle le taux de synthèse de cholestérol19,20. Cependant, ces médicaments abaissant le cholestérol inhibent également la formation des produits non-sterol le long de la voie de mévalonate. Par conséquent, une petite quantité de mévalonate est ajoutée pour permettre la formation de ces produits21 et d’améliorer la spécificité de cette approche. Une autre approche pour réduire le taux de cholestérol implique l’utilisation de ‘cyclodextrines. Ces monomers de glucopyranose possèdent une cavité hydrophobe interne avec un diamètre qui correspond à la taille des stérols22, ce qui facilite l’extraction du cholestérol des cellules, les appauvrissant ainsi de leur teneur en cholestérol indigène23. Un exemple est 2-hydroxypropyl—–cyclodextrine (HP-CD), un médicament préclinique actuellement testé pour le traitement de la maladie de type C Niemann-Pick, un trouble métabolique mortel héréditaire génétiquement héréditaire caractérisé par le stockage lysosomal de cholestérol24. Le niveau d’épuisement du cholestérol dépend du dérivé spécifique utilisé. Par exemple, HP-CD extrait le cholestérol avec une capacité inférieure au dérivé méthylé, méthyle–cyclodextrine (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Notamment, cependant, les cyclodextrines peuvent également extraire d’autres molécules hydrophobes en plus du cholestérol, ce qui peut alors entraîner des effets non spécifiques31. Contrairement à l’épuisement, les cellules et les tissus peuvent être spécifiquement enrichis avec le cholestérol par le traitement avec la cyclodextrine qui a été présaturée avec le cholestérol23. Cette approche peut également être utilisée comme un contrôle de la spécificité des cyclodextrines utilisées pour l’épuisement du cholestérol31. L’épuisement du cholestérol des tissus et des cellules est simple et peut être réalisé en exposant les cellules de 30 à 60 min à 5 mM M-CD dissous dans le milieu utilisé pour stocker les cellules. Cette approche peut entraîner une diminution de 50% de la teneur en cholestérol (par exemple, dans les neurones hippocampal32, les artères cérébrales rat33). D’autre part, la préparation du complexe de l’enrichissement du cholestérol et du cholestérol est plus complexe et sera décrite dans la section du protocole.
Une approche alternative à l’enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de la cyclodextrine saturée de cholestérol implique l’utilisation de LDL, qui repose sur les récepteurs LDL exprimés dans les tissus / cellules18. Bien que cette approche offre l’avantage d’utiliser la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule, elle a plusieurs limites. Tout d’abord, les tissus et les cellules qui n’expriment pas le récepteur LDL ne peuvent pas être enrichis en utilisant cette approche. Deuxièmement, les particules LDL contiennent d’autres lipides en plus du cholestérol. Plus précisément, LDL est composé de la protéine ApoB100 (25%) et les lipides suivants (75 %) : 6 à 8 % de cholestérol, 45 à 50 % d’ester de cholestéle, 18 à 24 % de phospholipides et 4 à 8 % de triacylglycerols34. Ainsi, l’administration du cholestérol via les particules LDL n’est pas spécifique. Troisièmement, le pourcentage d’augmentation de la teneur en cholestérol par LDL dans les tissus et les cellules qui expriment le récepteur LDL peut être significativement inférieur à l’augmentation observée à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol. Par exemple, dans une étude précédente, l’enrichissement des artères cérébrales rongeurs avec le cholestérol par l’intermédiaire de LDL a eu comme conséquence seulement une augmentation de 10-15% des niveaux de cholestérol35. En revanche, l’enrichissement de ces artères avec la cyclodextrine saturée de cholestérol tel que décrit dans la section du protocole a entraîné une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (Voir la section des résultats représentatifs, figure 1).
Modification des taux de cholestérol chez les oocytes Xenopus
Les ocytes Xénoopeus constituent un système d’expression hétérologue couramment utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Des études antérieures ont montré que le taux de cholestérol à la molaire phospholipide chez les oocytes Xenopus est de 0,5 à 0,136. En raison de ce niveau intrinsèque élevé de cholestérol, l’augmentation de la teneur en cholestérol dans ce système est difficile, mais peut être atteint en utilisant des dispersions faites à partir de phospholipides membranaires et le cholestérol. Les phospholipides que nous avons choisis à cette fin sont similaires à ceux utilisés pour former des bilayers de lipides planaires artificiels et comprennent L-phosphatidylethanolamine (POPE) et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), tel que décrit dans la section du protocole. Cette approche peut entraîner une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (voir la section des résultats représentatifs, figure 2).
Une approche alternative à l’enrichissement des oocytes Xenopus avec des dispersions à base de phospholipid implique l’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol, qui est similaire à la façon dont les tissus et les cellules sont enrichis. Cependant, nous avons constaté que cette approche était de faible reproductibilité et d’efficacité, avec une augmentation moyenne de 25 % de la teneur en cholestérol. Cela est peut-être dû à la capacité de chargement différente de ces deux approches (voir la section des résultats représentatifs, figure 3). En revanche, il a été démontré que l’utilisation de cyclodextrine pour épuiser le cholestérol des oocytes Xenopus peut entraîner une diminution de 40% de la teneur en cholestérol36.
Ici, nous nous concentrons sur l’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules de mammifères par l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol, et des oocytes Xenopus utilisant des liposomes. Les deux approches peuvent être exploitées pour délimiter l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction protéique. Les mécanismes de modulation de cholestérol de la fonction protéique peuvent impliquer des interactions directes8 et/ou des effets indirects9. Lorsque le cholestérol affecte la fonction protéique par le biais d’interactions directes, l’effet d’une augmentation du taux de cholestérol sur l’activité protéique est probablement indépendant du type cellulaire, du système d’expression ou de l’approche d’enrichissement. Par exemple, nous avons utilisé ces deux approches pour déterminer l’effet du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement (GIRK) de G-protéine (GIRK) exprimés dans les myocytes auriculaires37, neurones hippocampiques32,38, HEK29339 cellules, et Oocytes Xenopus 32,37. Les résultats obtenus dans ces études étaient cohérents : dans les trois types de cellules de mammifères et dans les oocytes amphibiens, le cholestérol a augmenté la fonction du canal GIRK (voir la section des résultats représentatifs, figure 4, pour les neurones hippocampiques et les expériences correspondantes dans les oocytes Xenopus). En outre, les observations faites dans ces études étaient également compatibles avec les résultats des études menées dans les myocytes auriculaires37,40 et neurones hippocampiques32,38 fraîchement isolés des animaux soumis à un régime à taux de cholestérol élevé40. Notamment, l’enrichissement du cholestérol des neurones hippocampal à l’aide de M -CD a inversé l’effet de la thérapie d’atorvastatine utilisée pour répondre à l’impact de l’alimentation à taux élevé de cholestérol à la fois sur les niveaux de cholestérol et la fonction GIRK38. Dans d’autres études, nous avons étudié l’effet des mutations sur la sensibilité au cholestérol du canal de potassium rectifiant intérieurement Kir2.1 utilisant les ocytes Xenopus et les cellules HEK29341. Encore une fois, l’effet des mutations sur la sensibilité du canal était similaire dans les deux systèmes.
Les applications des deux méthodes d’enrichissement pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol sur la fonction moléculaire, cellulaire et d’organe sont nombreuses. En particulier, l’utilisation de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les cellules et les tissus est très fréquente en grande partie en raison de sa spécificité. Des exemples récents de cette approche incluent la détermination de l’impact du cholestérol sur l’activation du canal HERG et les mécanismes sous-jacents42, la découverte que le cholestérol active le récepteur couplé à la protéine G Smoothened pour promouvoir la signalisation hérisson43, et l’identification du rôle du cholestérol dans la biomécanique des cellules souches et l’adipogenèse par les protéines linker associées à la membrane44. Dans nos propres travaux, nous avons utilisé l’enrichissement des tissus mammifères avec le complexe de cholestérol M-CD: pour étudier l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur la fonction de base et le profil pharmacologique des canaux de grande conductance de calcium et de tension (BK, MaxiK) dans le muscle lisse vasculaire35,45,46. Dans d’autres études, nous avons utilisé l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol pour déterminer les rôles des différentes régions dans les canaux Kir2.1 et GIRK dans la sensibilité au cholestérol41,47,48,49, ainsi que pour déterminer les sites de liaison de cholestérol putatif dans ces canaux32,50,51.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes d’enrichissement des tissus et des cellules des mammifères et des oocytes Xenopus avec le cholestérol constituent un outil puissant pour étudier l’effet des taux élevés de cholestérol sur les espèces moléculaires individuelles, sur les systèmes macromoléculaires complexes (p. ex. protéines) et sur la fonction cellulaire et des organes. Dans cet article, nous avons décrit deux approches complémentaires qui facilitent de telles études. Tout d’abord, nous avons décrit comment enri…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par une subvention pour le développement scientifique (11SDG5190025) de l’American Heart Association (à A.R.-D.), et par les subventions AA-023764 (à A.N.B.), et HL-104631 et R37 AA-11560 (à A.M.D.).
Materials
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
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