哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞
Summary
コレステロールを飽和させて哺乳動物の組織や細胞を豊かにするシクロデキストリンの適用と、ゼノプス卵母細胞を豊かにするコレステロールを豊富なリン脂質系分散液(リポソーム)の使用の2つの方法が提示される。これらの方法は、分子、細胞、および器官機能におけるコレステロール値の上昇の影響を決定するのに役立ちます。
Abstract
哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮は、細胞機能の研究に用いられるゼノプス卵母細胞を含め、様々な方法を用いて達成することができる。ここでは、この目的に用いられる2つの重要なアプローチについて説明します。まず、例として、脳動脈(組織)と海馬ニューロン(細胞)を用いてコレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて、コレステロールを有する組織や細胞を濃縮する方法を説明する。このアプローチは、あらゆるタイプの組織、細胞、または細胞株に使用できます。コレステロールの濃縮のための別のアプローチは、低密度リポタンパク質の使用を含む (LDL).このアプローチの利点は、それが細胞の自然なコレステロール恒常性機械の一部を使用することです.しかし、シクロデキストリンアプローチはコレステロールを有するあらゆる細胞タイプの関心を豊かにするために適用できるのに対し、LDLアプローチはLDL受容体を発現する細胞(例えば、肝臓細胞、血球球および組織マクロファージなどの骨髄由来細胞)に限定され、濃縮のレベルはLDL受容体の濃度および移動度に依存する。さらに、LDL粒子は他の脂質を含むが、コレステロール送達は非特異的である。第2に、コレステロールを含むリン脂質系分散体(すなわちリポソーム)を用いて、ゼノプス卵母細胞をコレステロールで濃縮する方法を説明する。ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に使用される一般的な異種発現系を構成する。哺乳動物組織(大脳動脈)のシクロデキストリン系コレステロール濃縮アプローチとゼノプス卵母細胞のリン脂質ベースのコレステロール濃縮アプローチの両方について、コレステロール値がインキュベーションの最大5分に達することを実証する。このコレステロールのレベルは、インキュベーションの長期期間(例えば、60分)の間に一定のままである。これらのデータは、コレステロール濃縮の影響を調べるための機能研究のために、組織、細胞、ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮のための最適化された時間的条件の基礎を提供します。
Introduction
コレステロールは、主要な細胞脂質、多数の重要な機能的および構造的役割11、2、3、4、5、6、7、8、92,3,4,5,6,7,8を9果たしている。原形質膜の物理的性質を調節することから、細胞の生存率を保証すること、増殖、増殖、および生化学的経路の多くのシグナル伝達および前駆体分子としての役割を果たすことまで、コレステロールは正常な細胞および器官機能に必要不可欠な構成要素である。その結果、コレステロール欠乏症は、重度の身体的奇形および様々な障害をもたらす。,一方、生理学的レベル(2-3x)以上のコレステロールのわずかな増加でさえ、細胞傷害性,11、2、102,10であり、心血管11、12、13および神経変性疾患111414、15、16、1715を含む障害の発症と関連している。16,171213このように、コレステロールの重要な機能を問い合わせて、コレステロール値の変化の影響を判断するために、組織、細胞、およびゼノプス卵母細胞中のコレステロールの含有量を変化させる異なるアプローチが開発されている。
哺乳類組織および細胞におけるコレステロール値の変化
いくつかのアプローチは、組織および細胞18におけるコレステロールのレベルを低下させるために利用することができる。1つのアプローチは、コレステロール合成19,20の速度を制御するHMG-CoA還元体を阻害するためにリポタンパク質欠損血清中に溶解したスタチンへのそれらの曝露を20含む。しかし、これらのコレステロール低下薬はまた、メバロント経路に沿った非ステロール製品の形成を阻害する。したがって、これらの製品21の形成を可能にし、このアプローチの特異性を高めるために少量のメバロン化物が添加される。コレステロール値を低下させるもう一つのアプローチは、β-シクロデキストリンの使用を含む.これらのグルココピー鼻モノマーは、ステロール22の大きさに一致する直径を有する内部疎水性キャビティを有し、細胞からのコレステロールの抽出を容易にし、それによってそれらの天然コレステロール含有量23からそれらを枯渇させる。その一例は、2−ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン(HPβCD)であり、ニーマンピック型C型疾患の治療のために現在試験されている前臨床薬物であり、リソソームコレステロール貯蔵24を特徴とする遺伝的に遺伝した致命的な代謝障害である。コレステロールの枯渇のレベルは、使用される特定の誘導体に依存します。例えば、HPβCDはメチル化誘導体よりも低容量のコレステロールを抽出し、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)24、25、26、27、28、29、30。29,3024,25,26,27,28,しかし、特に、β-シクロデキストリンはコレステロールに加えて他の疎水性分子を抽出することもできるが、その後、非特異的な効果を生じ得る31。枯渇とは対照的に、細胞および組織は、コレステロール23で予備飽和されたβ-シクロデキストリンによる処置を通じてコレステロールを特異的に濃縮することができる。このアプローチは、コレステロール枯渇31に用いられるβ-シクロデキストリンの特異性のコントロールとして用いることもできる。組織および細胞からのコレステロールの枯渇は簡単であり、細胞を貯蔵するために使用される培地に溶解した30〜60分間mMMβCDの細胞を曝露することによって達成することができる。このアプローチは、コレステロール含有量の50%の減少をもたらすことができます(例えば、海馬ニューロン32、ラット大脳動脈33)。一方、組織や細胞のコレステロール濃縮のためのβ-シクロデキストリン-コレステロール複合体の調製はより複雑であり、プロトコルセクションに記載される。
コレステロールを飽和させたβ-シクロデキストリンを用いて組織および細胞を濃縮する別のアプローチは、組織/細胞18に発現するLDL受容体に依存するLDLの使用を含む。このアプローチは、細胞の天然コレステロール恒常性機械を使用する利点を提供するが、それはいくつかの制限があります。第一に、LDL受容体を発現しない組織や細胞は、このアプローチでは濃縮できない。第二に、LDL粒子はコレステロールに加えて他の脂質を含む。具体的には、LDLは、タンパク質ApoB100(25%)で構成されています以下の脂質(75%):〜6〜8%コレステロール、〜45〜50%コレステリルエステル、〜18〜24%リン脂質、および〜4〜8%トリアシルグリセロール34。したがって、LDL粒子を介したコレステロールの送達は非特異的である。第三に、LDL受容体を発現する組織および細胞におけるLDLによるコレステロール含有量の増加の割合は、コレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて観察された増加よりも有意に低い場合がある。例えば、以前の研究では、LDLを介してコレステロールを有するげっ歯類の大脳動脈の濃縮は、コレステロール値の10〜15%の増加をもたらした35.対照的に、プロトコルセクションに記載されているようにコレステロールで飽和したシクロデキストリンを有するこれらの動脈の濃縮は、コレステロール含有量の50%の増加をもたらした(代表結果セクション、図1を参照)。
ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール値の変化
ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に一般的に使用される異種発現系を構成する。以前の研究では、ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール対リン脂質モル比は0.5±0.136であることを示している。コレステロールのこの本質的な高レベルのため、このシステムでコレステロールの含有量を増加させることは困難であり、まだ膜リン脂質とコレステロールから作られた分散を使用して達成することができます。この目的のために選択したリン脂質は、人工平坦脂質二重層の形成に使用されるものと類似しており、L-α-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)および1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-l-セリン(POPS)を含む。この方法では、コレステロールの含有量が 50% 増加する可能性があります (代表的な結果セクションを参照してください(図 2)。
リン脂質ベースの分散液でゼノプス卵母細胞を濃縮する別のアプローチは、組織および細胞が濃縮される方法に似ているコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用を含む。しかし、このアプローチは、コレステロール含有量の平均約25%の増加で、再現性と効率が低いことがわかりました。これは、これら 2 つのアプローチの負荷容量が異なる可能性があります (代表的な結果セクション、図 3を参照)。これに対し、ゼノプス卵母細胞からコレステロールを枯渇させるシクロデキストリンを使用すると、コレステロール含量が36%〜40%減少36する可能性があることが示されている。
ここでは、コレステロール飽和シクロデキストリンの適用と、リポソームを用いたゼノプス卵母細胞の適用を通じて、哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮に焦点を当てます。両方のアプローチは、タンパク質機能に対するコレステロールの増加レベルの効果を示すために利用することができます。タンパク質機能のコレステロール調節のメカニズムは、直接的な相互作用を伴うことがあります 8および/または間接的な効果9.コレステロールが直接相互作用を介してタンパク質機能に影響を与える場合、コレステロール値の増加がタンパク質活性に及ぼす影響は、細胞の種類、発現系、または濃縮アプローチとは無関係である可能性が高い。例えば、心房筋細胞37、39海馬ニューロン32、38、HEK2933,38細胞、およびゼノプス卵母細胞32,37において発現される内向きに整流されたG-gatedG-gated(GIRK)チャネルに対するコレステロールの影響を決定するために、37これら2つのアプローチを利用した。これらの研究で得られた結果は一貫していた:哺乳類細胞のすべての3つのタイプおよび両生類卵母細胞でコレステロールアップレギュレートGIRKチャネル関数(海馬ニューロンおよびゼノプス卵母細胞における対応する実験については、代表的な結果セクション、図4を参照)。さらに、これらの研究で行われた観察はまた、心房筋細胞37、40および海馬ニューロン4032、38,38で行われた研究の結果と一致した高コレステロール食,40を受けた動物から新たに単離した。特に、MβCDを用いた海馬ニューロンのコレステロール濃縮は、コレステロール値及びGIRK機能38に対する高コレステロール食の影響に対処するために用いられるアトルバスタチン療法の効果を逆転させた。他の研究では、ゼノプス卵母細胞およびHEK293細胞41の両方を用いて、内向きに整流カリウムチャネルKir2.1のコレステロール感受性に対する突然変異の影響を調べた。繰り返しますが、チャネルの感受性に対する突然変異の影響は、2つのシステムで同様であった。
コレステロール値上昇が分子、細胞、臓器機能に及ぼす影響を判定するための両方の濃縮方法の応用は数多くある。特に、細胞や組織を豊かにするシクロデキストリン-コレステロール複合体の使用は、その特異性が大きく広がることが多い。このアプローチの最近の例としては、HERGチャネル活性化及び基礎機構42に対するコレステロールの影響の決定、コレステロールがヘッジホッグシグナル伝達43を促進するためにSmoothenedGタンパク質結合受容体Smoothenedを活性化するという発見、および膜関連リンカータンパク質44を介した幹細胞バイオメカニクスおよび有分形成におけるコレステロールの役割の同定を含む。私たち自身の研究では、MβCD:コレステロール複合体を用いた哺乳類組織濃縮を利用して、コレステロールの富化が血管平滑筋35,45,46,の大きな導電度(BK,MaxiK)のカルシウムおよび電圧ゲートチャネルの基本的機能35,および薬理学的プロファイルに及ぼす影響を研究しました。46他の研究では、コレステロールを伴う,ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのリン脂質ベースの分散アプローチを用いて、コレステロール感受性41、47、48、49,47,48におけるKir2.1およびGIRKチャネルにおける異なる領域の役割を決定し、ならびに49これらのチャネル32、50、51において32,50,51コレステロール結合部位を決定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
哺乳類の組織や細胞、コレステロールを含むゼノプス卵母細胞を豊かにする方法は、個々の分子種、複雑な高分子系(タンパク質など)、細胞および器官機能に対するコレステロール値の上昇の影響を調査するための強力なツールです。本論文では、このような研究を促進する2つの補完的なアプローチについて述べた。まず、コレステロールを飽和したMβCDを用いてコレステロールを有?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国心臓協会(A.R.-D.)の科学者開発助成金(11SDG5190025)と国立衛生研究所R01助成金AA-023764(A.N.B.)、HL-104631およびR37 AA-11560(A.M.D.)によって支援されました。
Materials
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
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