Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale
Summary
Wir beschreiben die Isolierung, Dispersion und Beschichtung von Zellstoff (DP) Primärzellen mit trigeminalen (TG) Neuronen, die auf darüber liegenden Transwellfiltern kultiviert sind. Zelluläre Reaktionen von DP-Zellen können mit Immunfluoreszenz oder RNA/Protein-Analyse analysiert werden. Die Immunfluoreszenz neuronaler Marker mit konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Analyse von Neuriten-Auswuchsreaktionen.
Abstract
Zahninnervation ermöglicht es Den Zähnen, Druck, Temperatur und Entzündungen zu spüren, die alle für die Verwendung und Wartung des Zahnorgans entscheidend sind. Ohne sensorische Innervation würden tägliche orale Aktivitäten irreparable Schäden verursachen. Trotz ihrer Bedeutung wurden die Rollen der Innervation in der Zahnentwicklung und -pflege weitgehend übersehen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass DP-Zellen extrazelluläre Matrixproteine und Parakrinsignale absondern, um TG-Axone in und durch den Zahn zu ziehen und zu führen. Allerdings haben nur wenige Studien detaillierte Einblicke in den Crosstalk zwischen dem DP-Mesenchym und neuronalen Afferents geliefert. Um diese Wissenslücke zu schließen, haben Forscher begonnen, Kokulturen und eine Vielzahl von Techniken zu nutzen, um diese Wechselwirkungen zu untersuchen. Hier zeigen wir die verschiedenen Schritte bei der Ko-Kultivierung primärer DP-Zellen mit TG-Neuronen, die auf einem darüber liegenden Transwell-Filter mit poren großen Durchmessern verteilt sind, um das axonale Wachstum durch die Poren zu ermöglichen. Primäre DP-Zellen mit dem von loxP-Sites flankierten Gen von Interesse wurden genutzt, um die Genlöschung mit einem Adenovirus-Cre-GFP-Rekombinatossystem zu erleichtern. Die Verwendung von TG-Neuronen aus der Thy1-YFP-Maus ermöglichte eine präzise affekte Bildgebung mit einer Expression, die durch konfokale Mikroskopie deutlich über dem Hintergrundniveau liegt. Die DP-Antworten können durch Protein- oder RNA-Sammlung und -Analyse oder alternativ durch immunfluoreszierende Färbung von DP-Zellen untersucht werden, die auf abnehmbaren Glasabdeckungen plattiert sind. Medien können mit Techniken wie proteomischen Analysen analysiert werden, obwohl dies eine Erschöpfung des Albums aufgrund des Vorhandenseins von fetalem Rinderserum in den Medien erfordert. Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, die manipuliert werden kann, um die morphologischen, genetischen und zytoskelettalen Reaktionen von TG-Neuronen und DP-Zellen als Reaktion auf die kontrollierte Umgebung eines Co-Kultur-Assays zu untersuchen.
Introduction
Zahninnervation ermöglicht es Den Zähnen, Druck, Temperatur und Entzündungen zu spüren, die alle für die Verwendung und Wartung des Zahnorgans entscheidend sind. Wenn Zahnschmerzen im Zusammenhang mit Zahnkaries und Trauma nicht wahrkommen, führt dies zum Fortschreiten der Erkrankung. Daher ist eine richtige Innervation eine Voraussetzung für normales Zahnwachstum, Funktion und Pflege.
Während die meisten Organe zum Zeitpunkt der Geburt voll funktionsfähig und innerviert sind, erstreckt sich die Zahnentwicklung bis ins Erwachsenenleben, wobei Zahninnervation und Mineralisierung in den postnatalen Stadien1,2konzertant auftreten. Interessanterweise sezerniert das Zahnpulp (DP) Mesenchym zunächst abstoßende Signale während der Embryogenese, um das Eindringen von Axon in das sich entwickelnde Zahnorgan zu verhindern, das sich später auf die Sekretion von Anziehungskraftfaktoren verlagert, wenn sich der Zahn dem Ausbruchnähert 3,4. Während der postnatalen Stadien dringen afferent Axone aus dem trigeminalen (TG) Nerv in und durch den Zahn um die Zeit, in der die Dentinablagerung beginnt (rezensiert in Pagella, P. et al.5). Mehrere In-vivo-Studien haben gezeigt, dass neuronal-mesenchymale Wechselwirkungen die Zahninnervation bei Mäusen leiten (in Luukko, K. et al.6), aber nur wenige Details der molekularen Mechanismen sind verfügbar.
Zellkokulturen bieten kontrollierte Umgebungen, in denen Forscher Wechselwirkungen zwischen neuronalen und mesenchymalen Populationen manipulieren können. Co-Kultur-Experimente ermöglichen es, tiefer in die Signalwege einzutauchen, die Zahninnervation und Entwicklung leiten. Einige der konventionellen Methoden zur Untersuchung von Zellen in der Kokultur stellen jedoch technische Herausforderungen dar. Zum Beispiel kann die kristallviolette Färbung von Neuritenauswüchsen Schwann-Zellen, die in TG-Bündeldispersionen enthalten sind, nicht spezifisch färben, und es kann Spitzen in der Farbintensität mit relativ kleinen Antwortengeben 7. Mikrofluidische Kammern bieten eine attraktive Option, sind aber deutlich teurer als Transwell-Filter8,9 und erlauben nur die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf DP-Sekrete. Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein Protokoll entwickelt, das a) präzise Färbung und Bildgebung des TG-Neuritenwachstums als Reaktion auf DP-Sekrete, b) genetische Modifikation von DP-Zellen und/oder TG-Neuronen zur Untersuchung spezifischer Signalwege und c) Die Untersuchung von DP-Zellreaktionen auf Faktoren ermöglicht, die von TG-Neuronen sezerniert werden. Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, mehrere Merkmale der Zahninnervation in der kontrollierten Umgebung eines In-vitro-Co-Kultur-Assays genau zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die täglichen Aktivitäten der Mundhöhle erfordern, dass die Zähne äußere Reize und innere Entzündungen spüren, um eine ordnungsgemäße Nutzung und Wartung zu ermöglichen. Es liegen jedoch nur begrenzte Informationen über die Signale vor, die die Entwicklungsprozesse der Zahninnervation vorantreiben. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung und Kokultur primärer DP-Zellen und TG-Neuronen, um die Kreuzkommunikation zwischen den beiden Populationen zu untersuchen. Mehrere Variablen wurden optimiert un…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von a) den National Institutes of Health/NIAMS (Grant Numbers R01 AR062507 und R01 AR053860 to RS), b) der University of Alabama at Birmingham Dental Academic Research Training (DART) Grant (Nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) an SBP vom National Institute of Dental and Craniofacial Research/National Institutes of Health, c) ein UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) Pilot- und Machbarkeitsstipendium an SBP und d) das National Institute of Dental and Craniofacial Forschungs-/National Institutes of Health K99 DE024406 Zuschuss an SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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