Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária
Summary
Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.
Abstract
A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. Sem inervação sensorial, atividades orais diárias causariam danos irreparáveis. Apesar de sua importância, os papéis de inervação no desenvolvimento e manutenção dos dentes têm sido largamente negligenciados. Vários estudos demonstraram que as células DP secretam proteínas de matriz extracelular e sinais de paracrina para atrair e guiar axônhons TG para dentro e por todo o dente. No entanto, poucos estudos forneceram uma visão detalhada do crosstalk entre o mesenchyme DP e os afíferos neuronais. Para abordar essa lacuna de conhecimento, os pesquisadores começaram a utilizar co-culturas e uma variedade de técnicas para investigar essas interações. Aqui, demonstramos os múltiplos passos envolvidos na co-culturing células DP primárias com neurônios TG dispersos em um filtro transwell sobreposto com poros de grande diâmetro para permitir o crescimento axonal através dos poros. Células DP primárias com o gene de interesse ladeado por sites loxP foram utilizadas para facilitar a exclusão genética usando um sistema de recombinase Adenovirus-Cre-GFP. O uso de neurônios TG do mouse Thy1-YFP permitiu imagens afáveis precisas, com expressão bem acima dos níveis de fundo por microscopia confocal. As respostas dp podem ser investigadas através de coleta e análise de proteínas ou RNA, ou alternativamente, através de coloração imunofluorescente de células DP banhadas em tampas de vidro removíveis. A mídia pode ser analisada usando técnicas como análises proteômicas, embora isso exija esgotamento de albumina devido à presença de soro bovino fetal na mídia. Este protocolo fornece um método simples que pode ser manipulado para estudar as respostas morfológicas, genéticas e citosesqueléticas de neurônios TG e células DP em resposta ao ambiente controlado de um ensaio de co-cultura.
Introduction
A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. A não sentir dor dentária associada a cárie dentária e trauma leva à progressão da doença. Assim, a interioração adequada é uma exigência para o crescimento normal dos dentes, função e cuidado.
Enquanto a maioria dos órgãos são totalmente funcionais e internados no momento do nascimento, o desenvolvimento dentário se estende à vida adulta, com a inervação dentária e mineralização ocorrendo em concerto durante os estágios pós-parto1,2. Curiosamente, o mesenchyme de polpa dentária (DP) inicialmente secreta sinais repelentes durante embriogênese para evitar a entrada de axônono no órgão dentário em desenvolvimento, que mais tarde muda para a secreção de fatores atrativos à medida que o dente se aproxima da erupção3,4. Durante os estágios pós-natal, axôndegas afízios do nervo trigeminal (TG) penetram dentro e em todo o dente em torno do momento em que começa o depoimento dentin (revisado em Pagella, P. et al.5). Vários estudos in vivo demonstraram que interações neuronal-mesenquimicas guiam a interioração dentária em camundongos (revisadas em Luukko, K. et al.6),mas poucos detalhes dos mecanismos moleculares estão disponíveis.
As coculturas celulares fornecem ambientes controlados nos quais os pesquisadores podem manipular interações entre populações neuronais e mesenquinais. Experimentos de cocultura tornam possível aprofundar-se nos caminhos de sinalização que orientam a interioração e o desenvolvimento dos dentes. No entanto, vários dos métodos convencionais utilizados para estudar células na cocultura apresentam desafios técnicos. Por exemplo, a coloração violeta cristalina do crescimento neurite pode não especificamente manchar as células schwann incluídas nas dispersões de feixe de TG, e pode haver picos de intensidade de cor com respostas relativamente pequenas7. As câmaras microfluidas oferecem uma opção atraente, mas são consideravelmente mais caras do que os filtros transwell8,9 e só permitem a investigação de respostas neuronais às secreções dp. Para abordar essas questões, desenvolvemos um protocolo que permite: a) a) a) manipulação precisa e imagem do crescimento neurite TG em resposta às secreções DP, b) modificação genética das células DP e/ou neurônios TG para investigar caminhos específicos de sinalização e c) investigação de respostas de células DP a fatores secretos pelos neurônios TG. Este protocolo fornece a capacidade de investigar com precisão várias características de innervation dentária no ambiente controlado de um ensaio de co-cultura in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
As atividades diárias da cavidade oral exigem que os dentes sentem estímulos externos e inflamação interna, a fim de permitir o uso e manutenção adequados. No entanto, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre os sinais que impulsionam os processos de desenvolvimento da interioração dentária. Este protocolo fornece um método para isolar e co-cultura células DeP primárias e neurônios TG, a fim de estudar a comunicação cruzada entre as duas populações. Várias variáveis foram otimizadas e d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por a) os Institutos Nacionais de Saúde/NIAMS (números de subvenção R01 AR062507 e R01 AR053860 para RS), b) bolsa da Universidade do Alabama no Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) para sBP do Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial/Instituto Nacional de Saúde, c) um Centro Global de Transtornos Craniofaciais, Bucais e Dentários (GC-CODED) Bolsa piloto e viabilidade ao SBP e d) do Instituto Nacional de Odontologia e Craniofacial Pesquisa/Institutos Nacionais de Saúde K99 DE024406 bolsa ao SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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