Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée
Summary
Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.
Abstract
Les xénogreffes d’origine patiente (PDX), générées lors de la résécation du tissu tumoral du patient, sont greffées directement en souris immunocompromisées, demeurent biologiquement stables, préservant ainsi les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques, ainsi que l’hétérogénéité de la tumeur originale. Toutefois, l’utilisation de ces modèles pour effectuer une multitude d’expériences, y compris le dépistage des drogues, est prohibitif tant en termes de coût que de temps. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont largement considérés comme des plates-formes dans lesquelles les cellules cancéreuses conservent leur intégrité biologique grâce aux interactions biochimiques, à la morphologie et à l’architecture. Notre équipe a une vaste expérience de la culture des cellules PDX in vitro à l’aide de matrices 3D composées d’acide hyaluronique (HA). Afin de séparer les cellules stromal fibroblastes de souris associées aux PDX, nous utilisons la culture de rotation, où les cellules stromal adhèrent à la surface des plaques traitées par culture tissulaire tandis que les cellules tumorales DISSOCIées pdx flottent et s’associent en grappes multicellulaires. Les cellules simples, souvent mortes, qui présentent un défi dans la collecte de clusters PDX viables pour l’encapsulation en aval dans les hydrogels pour la culture cellulaire 3D, flottent également dans le surnatant. Afin de séparer ces cellules simples des grappes cellulaires vivantes, nous avons utilisé la centrifugation de gradient d’étape de densité. Le protocole décrit ici permet l’épuisement des cellules célibataires non viables de la population saine des grappes cellulaires qui seront utilisées pour d’autres expérimentations in vitro. Dans nos études, nous intégrons les cultures 3D dans des plaques microfluidiques qui permettent la perfusion des médias pendant la culture. Après avoir évalué les cultures qui en résultent à l’aide d’un test de viabilité basé sur l’image fluorescente des cellules purifiées par rapport aux cellules non purifiées, nos résultats montrent que cette étape de séparation supplémentaire a considérablement réduit le nombre de cellules non viables de nos cultures.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, le domaine de la recherche sur le cancer a démontré un regain d’enthousiasme pour les xénogreffes dérivées du patient (PDX) comme outil d’évaluation de la dépendance aux voies cancéreuses et de la susceptibilitéaux médicaments 1. Les modèles PDX les plus courants sont établis par implantation sous-cutanée ou orthotopique de cellules tumorales humaines — un fragment tumoral, un groupe de cellules dérivées de tumeurs dissociées ou un échantillon de cellules tumorales circulantes isolées (CTC) — dans un hôte de rongeurs. Si la tumeur « prendre » est un succès, les cellules xénogreffe proliférera, vasculariser, et autrement interagir avec le tissu hôte pour créer une tumeur, qui peut être récolté à une taille optimale, subdivisé, et ré-implanté dans d’autres hôtes. Parmi leurs nombreux avantages en tant que système modèle, les PDX conservent généralement une partie substantielle de l’hétérogénéité de la population de cellules tumorales indigènes et permettent l’évaluation des voies et des réponses cellulaires spécifiques àl’homme 2,3. Le contexte in vivo permet l’interaction de tumeur avec la vascularisation et d’autres stroma adjacents et récapitule des caractéristiques de tissu telles que la dynamique de diffusion de drogue, la tension d’oxygène, et l’influence extracellulaire de matrice qui influencent biologiquement et mécaniquement la progression de tumeur. Un aspect négatif des PDXs est leur dépendance sur un hôte de rongeur, à la fois pour l’expansion de tumeur et finalement pour l’essai d’hypothèse. Étant donné que de nombreux PDX ne peuvent pas s’adapter à la culture bidimensionnelle traditionnelle (2D) sur le polystyrène de culture tissulaire sans perdre bon nombre de leurs caractéristiques souhaitables, il y a eu un juste milieu minimal pour les chercheurs entre cette méthode in vitro relativement contrôlée et l’augmentation significative des dépenses, des installations et des besoins en temps pour l’utilisation in vivo PDX.
Nous avons décrit plusieurs modèles in vitro qui mettent en œuvre la culture cellulaire 3D au sein d’une matrice de soutien, et avons récemment élargi ce travail pour démontrer la culture ex vivo des PDX dérivés du cancer de la prostate multiple (PCa), seuls et en co-culture avec des fibroblastes dérivés de lamoelle osseuse 4,5. Les matrices hydrogel à base d’acide hyaluronique (HA) fournissent un soutien personnalisable et biologiquement pertinent pour les deux types de cellules, avec un contrôle facile sur les caractéristiques hydrogel et la clarté optique pour l’imagerie à travers la profondeur hydrogel6.
Les tissus tumoraux PDX matures comprennent un mélange variable de cellules cancéreuses humaines hétérogènes et de stroma de souris (fibroblastes, cellules endothéliales, etc.). Pour étudier les contributions spécifiques de type cellulaire à la progression tumorale in vitro, il peut être avantageux de dissocier les tumeurs, de séparer les populations cellulaires et de les incorporer expérimentalement de manière organisée pour disséquer les voies de communication intercellulaire. Les populations mixtes de cellules dans les digestates tissulaires ont une compatibilité différentielle avec des conditions de culture spécifiques. Par exemple, la viabilité fibroblaste associée à la tumeur nécessite soit une adhérence de surface, soit des matrices 3D fonctionnalisées avec des ligands d’intégrine, tandis que les cellules PDX épithéliales n’ont généralement pas ces exigences, favorisant plutôt les interactions cellule-cellule. Ces différences peuvent être exploitées pour assurer une séparation efficace des cellules PDX des cellules stromales de la souris contaminantes. La culture de rotation des digestates tissulaires permet l’adhérence des cellules stromales à la surface de la culture tissulaire tandis que les adhérences cellule-cellule conduisent les cellules PDX flottant au-dessus de la surface de culture rotative pour former des grappes multicellulaires dans le supernatant à 24−48 h. Les caractéristiques spécifiques de ces grappes varient selon le PDX (p. ex., de grandes grappes serrées, hautement sphériques ou des agrégats plus petits et plus lâches ressemblant à des grappes de raisin), mais sont généralement de tailles biologiquement pertinentes (50−250 μm de diamètre), suffisantes pour évaluer les interactions cellulaires qui reposent sur des contacts intercellulaires.
La récupération et le traitement des tumeurs entraîne inévitablement un certain degré de mort collatérale des cellules, soit en raison de dommages à court terme causés par des perturbations mécaniques/enzymatiques, soit d’une incompatibilité à long terme des sous-populations avec les conditions de culture choisies. Malgré l’utilité de la culture de rotation comme séparation initiale en vrac, les cellules mortes ou mourantes sont inévitablement transférées avec les clusters PDX et peuvent influencer la culture qui en résulte. Ces cellules mortes sont souvent des cellules PDX individuelles qui n’ont pas été intégrées dans un cluster, des fibroblastes stromaux de souris qui ne peuvent survivre dans des conditions de culture sélectionnées, ou des cellules endothéliales particulièrement fragiles. Ces cellules mourantes peuvent influencer les résultats expérimentaux des « survivants » et avoir un impact important sur la quantification, par exemple par le biais d’analyses de dépistage de la viabilité basées sur l’image fluorescente. Pour améliorer la sélection des cellules PDX vivantes de cette méthode, nous avons adapté les méthodes de centrifugation avec des étapes de densité pour éliminer facilement les cellules mortes/mourantes individuelles des mélanges PDX et conserver principalement des clusters multicellulaires vivants.
Afin d’améliorer l’étude des grappes dérivées de PDX en culture 3D, nous avons utilisé une plate-forme de culture de perfusion basée sur les microfluidiques, l’OrganoPlate (Figure 1), qui est une plate-forme de culture de perfusion à haut débit qui permet une culture simultanée de jusqu’à 96 cultures individuelles perfusées et 3D sur une base de plaques de microtiter de 384 puits(figure 1A)7,8. Dans la plaque microfluidique à deux voies, une seule puce tissulaire est reliée par deux canaux microfluidiques(figure 1B,canal gel : rouge, canal de perfusion : bleu) qui s’étendent sur quatre puits d’affilée. Les deux canaux microfluidiques sont séparés par une courte crête en plastique appelée Phaseguide qui empêche le débordement d’un canal dans son canal voisin adjacent, et permet simultanément une interface sans membrane entre le contenu du gel et le canal de perfusion9. Parce que le fond de la plaque microfluidique est composé de verre de qualité microscope, les cultures peuvent être visualisées dans la fenêtre d’observation à travers le fond de la plaque avec un microscope standard ou automatisé. La perfusion est établie dans la plaque microfluidique avec un rocker programmable, utilisant la gravité pour conduire les médias à travers les canaux microfluidiques, entre les puits du réservoir (figure 1C). Le flow-mimic de perfusion récapitule plus étroitement le microenvironnement de tumeur que la culture statique, permettant l’incorporation du stress de cisaillement et la distribution accrue des gaz et des éléments nutritifs. Les avantages du maintien d’une culture perfusée de cellules cancéreuses dans la plaque microfluidique ont été précédemment décrits comme cultures perfusées de cancer du sein ont montré la viabilité optimale par rapport à une culture statique de 3D des mêmes cellules7.
Le présent rapport décrit une méthode adaptée de centrifugation du gradient de densité pour isoler les clusters PDX multicellulaires vivants et démontre son utilité dans l’établissement de cultures 3D PDX dans des plaques microfluidiques perfusables. Étant donné qu’un nombre croissant de laboratoires de recherche cherchent des méthodes pour faciliter l’utilisation du PDX, nous prévoyons que les protocoles présentés ici seront d’une utilité immédiate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous décrivons une méthode pour traiter et cultururing les cellules viables de tumeur PDX-dérivées dans un système de culture 3D perfusé à haut débit. Tandis que ce protocole utilise le tissu de PCa PDX, il est également efficace pour d’autres tumeurs épithéliales-dérivées. Les caractéristiques tumorales varient d’une lignée PDX à l’autre, même dans le même tissu d’origine (prostate, sein, etc.). Certaines lignées PCa PDX sont plus fibrotiques et difficiles à isoler les cellules viables de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) et P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Referenzen
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