Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa
Summary
Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.
Abstract
Gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), generati quando il tessuto tumorale del paziente reinsediato viene innestato direttamente in topi immunocompromessi, rimangono biologicamente stabili, preservando così le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche, nonché l’eterogeneità del tumore originale. Tuttavia, l’uso di questi modelli per eseguire una moltitudine di esperimenti, incluso lo screening farmacologico, è proibitivo sia in termini di costi che di tempo. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono ampiamente visti come piattaforme in cui le cellule tumorali mantengono la loro integrità biologica attraverso interazioni biochimiche, morfologia e architettura. Il nostro team ha una vasta esperienza nella coltivazione di cellule PDX in vitro utilizzando matrici 3D composte da acido ialuronico (HA). Al fine di separare le cellule stromali dei fibroblasti di topo associate ai PDX, usiamo la coltura di rotazione, dove le cellule stromali aderiscono alla superficie delle placche trattate con coltura tissutale mentre le cellule tumorali PDX dissociate galleggiano e si associano in ammassi multicellulari. Fluttuanti anche nel supernatante sono singole, spesso cellule morte, che presentano una sfida nella raccolta di cluster PDX vitali per l’incapsulamento a valle in idrogel per la coltura cellulare 3D. Per separare queste singole cellule dagli ammassi di cellule vive, abbiamo impiegato la centrifugazione gradiente del passo di densità. Il protocollo qui descritto consente l’esaurimento di singole cellule non vitali dalla popolazione sana di cluster cellulari che saranno utilizzati per ulteriori sperimentazioni in vitro. Nei nostri studi, incorporiamo le colture 3D in piastre microfluidiche che consentono la perfusione dei supporti durante la coltura. Dopo aver valutato le colture risultanti utilizzando un saggio di vitalità fluorescente basato su immagini di cellule purificate rispetto a quelle non purificate, i nostri risultati mostrano che questo ulteriore passaggio di separazione ha ridotto sostanzialmente il numero di cellule non vitali dalle nostre colture.
Introduction
Nell’ultimo decennio, il campo della ricerca sul cancro ha dimostrato un rinnovato entusiasmo per gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) come strumento per valutare la dipendenza dal percorso delle cellule tumorali e la suscettibilità ai farmaci1. I modelli PDX più comuni sono stabiliti dall’impianto sottocutaneo o ortotopico delle cellule tumorali umane – un frammento tumorale, un ammasso di cellule dissociate derivate dal tumore o un campione di cellule tumorali circolanti isolate (CTC) – in un ospite di roditori. Se il tumore “take” ha successo, le cellule xenograft proliferano, vascolarizzano e altrimenti interagiscono con il tessuto ospite per creare un tumore, che può essere raccolto a una dimensione ottimale, suddiviso e reimpiantato in altri ospiti. Tra i loro numerosi vantaggi come sistema modello, i PDX in genere mantengono una parte sostanziale dell’eterogeneità della popolazione di cellule tumorali native e consentono la valutazione delle vie specifiche dell’uomo e delle rispostecellulari 2,,3. Il contesto in vivo consente l’interazione tumorale con la vascuola e altri stroma adiacenti e ricapitola caratteristiche tissutali come la dinamica di diffusione del farmaco, la tensione dell’ossigeno e l’influenza della matrice extracellulare che influenzano biologicamente e meccanicamente la progressione tumorale. Un aspetto negativo dei PDX è la loro dipendenza da un ospite di roditori, sia per l’espansione del tumore che, in ultima analisi, per il test delle ipotesi. Poiché molti PDX non possono adattarsi alla tradizionale coltura bidimensionale (2D) sul polistirolo di coltura tissutale senza perdere molte delle loro caratteristiche desiderabili, c’è stata una minima via di mezzo per i ricercatori tra questo metodo in vitro relativamente controllato e il significativo aumento delle spese, delle strutture e dei requisiti di tempo per l’uso in vivo di PDX.
Abbiamo descritto più modelli in vitro che implementano la coltura cellulare 3D all’interno di una matrice di supporto, e recentemente ampliato quel lavoro per dimostrare la coltura ex vivo di PDX derivati dal cancro alla prostata multipla (PCa), sia da soli che in co-coltura con fibroblasti derivati dal midolloosseo 4,,5. Le matrici idrogel a base di acido ialuronico (HA) forniscono un supporto personalizzabile e biologicamente rilevante per entrambi i tipi di cellule, con facile controllo sulle caratteristiche dell’idrogel e chiarezza ottica per l’imaging attraverso la profondità dell’idrogel6.
I tessuti tumorali PDX maturi comprendono una miscela variabile di cellule tumorali umane eterogenee e stroma del topo (fibroblasti, cellule endoteliali, ecc.). Per studiare i contributi specifici di tipo cellulare alla progressione tumorale in vitro, può essere vantaggioso dissociare i tumori, separare le popolazioni cellulari e incorporarle sperimentalmente in modo organizzato per sezionare percorsi di comunicazione intercellulare. Le popolazioni di cellule miste all’interno dei digestati tissutali hanno compatibilità differenziale con specifiche condizioni di coltura. Ad esempio, la vitalità dei fibroblasti associati al tumore richiede aderenza alla superficie o matrici 3D funzionalizzate con ligandi integrini, mentre le cellule PDX derivate dall’epiteliale in genere non hanno questi requisiti, favorendo invece le interazioni cellula-cellula. Queste differenze possono essere sfruttate per ottenere un’efficace separazione delle cellule PDX dalla contaminazione delle cellule stromali del topo. La coltura di rotazione dei digestati tissutali consente l’aderenza delle cellule stromali alla superficie di coltura tissutale mentre le aderenze cellulare-cellulari guidano le cellule PDX che galleggiano sopra la superficie di coltura rotante per formare ammassi multicellulari nel supernatante in 24−48 h. Le caratteristiche specifiche di questi ammassi variano con il PDX (ad esempio, ammassi grandi, stretti, altamente sferici o aggregati più piccoli e più sciolti simili a grappoli d’uva), ma sono tipicamente di dimensioni biologicamente rilevanti (50−250 μm di diametro), sufficienti per valutare le interazioni cellulari che si basano su contatti intercellulari.
Il recupero e l’elaborazione del tumore si trae inevitabilmente da un certo grado di morte cellulare collaterale, a causa di danni a breve termine dovuti a interruzioni meccaniche / enzimatiche o incompatibilità a lungo termine delle sottopopolazioni con le condizioni di coltura scelte. Nonostante l’utilità della coltura di rotazione come separazione iniziale di massa, le cellule morte o morenti vengono inevitabilmente trasferite con i cluster PDX e possono influenzare la coltura risultante. Queste cellule morte sono spesso singole cellule PDX che non sono state integrate in un ammasso, fibroblasti stromali del topo che non possono sopravvivere in condizioni di coltura selezionate, o cellule endoteliali particolarmente fragili. Tali cellule morenti possono influenzare i risultati sperimentali dei “sopravvissuti” e possono avere un impatto sostanziale sulla quantificazione, ad esempio attraverso test di screening di fattibilità fluorescenti basati su immagini. Per migliorare la selezione di cellule PDX vive da questo metodo, abbiamo adattato i metodi di centrifugazione con passaggi di densità per rimuovere facilmente singole cellule morte / morenti dalle miscele PDX e trattenere prevalentemente cluster multicellulari vivi.
Per migliorare lo studio dei cluster derivati da PDX risultanti in coltura 3D, abbiamo utilizzato una piattaforma di coltura perfusione basata sulla microfluidica, organoplate (Figura 1), che è una piattaforma organ-on-a-chip ad alta produttività che consente una coltura simultanea fino a 96 singole colture 3D perfuse su una base di piastre a microtitro a 384 pozzi(Figura 1A)7,8. Nella piastra microfluidica a 2 corsie, un singolo chip tissutale è collegato da due canali microfluidici(Figura 1B,canale gel: rosso, canale di perfusione: blu) che si estendono su quattro pozzi di fila. I due canali microfluidici sono separati da una breve cresta di plastica chiamata Phaseguide che impedisce l’overflow di un canale nel suo canale adiacente vicino, e allo stesso tempo consente un’interfaccia priva di membrana tra il contenuto del gel e il canale di perfusione9. Poiché il fondo della piastra microfluidico è composto da vetro di grado microscopio, le colture possono essere visualizzate nella finestra di osservazione attraverso il fondo della piastra con un microscopio standard o automatizzato. La perfusione è stabilita nella piastra microfluidica con un rocker programmabile, utilizzando la gravità per guidare i mezzi attraverso i canali microfluidici, tra i pozzi del serbatoio (Figura 1C). Il flusso di perfusione imita più da vicino il microambiente tumorale rispetto alla coltura statica, consentendo l’incorporazione dello stress da taglio e una maggiore distribuzione di gas e sostanze nutritive. I benefici del mantenimento di una coltura cellulare tumorale perfusa nella piastra microfluidica sono stati precedentemente descritti come colture perfuse di cancro al seno che mostravano una vitalità ottimale rispetto a una coltura 3D statica delle stessecellule 7.
Il presente rapporto descrive un metodo di centrifugazione del gradiente di densità adattato per isolare i cluster PDX multicellulari vivi e dimostra la sua utilità nella creazione di colture PDX 3D all’interno di piastre microfluidiche perfusabili. Poiché un numero crescente di laboratori di ricerca sta cercando metodi per facilitare l’uso del PDX, prevediamo che i protocolli qui presentati saranno di utilità immediata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo per elaborare e coltivare cellule tumorali vitali derivate da PDX in un sistema di coltura 3D ad alta produttività e perfuso. Mentre questo protocollo utilizza tessuto PCa PDX, è ugualmente efficace per altri tumori derivati epiteliali. Le caratteristiche tumorali variano tra le singole linee PDX anche all’interno dello stesso tessuto di origine (prostata, seno, ecc.). Alcune linee PCa PDX sono più fibrotiche e difficili da isolare le cellule vitali mentre altre sono più cellulari. La dimens…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Referenzen
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