מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית
Summary
אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.
Abstract
העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.
Introduction
מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)1. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטרוגנית גבוהה של תאים ורוצה לנתח פנוטיפים ברמה תא יחיד.
בתחילה, ניתוחים כגון ספירת וקדי בוצעו על ידי עין, אשר מועדף על ידי כמה חוקרים שכן הוא מספק שליטה ויזואלית מלאה על תהליך הספירה. עם זאת, ניתוח ידני של נתונים כאלה ארוך מדי, מוביל לשונות בין משקיפים, ואינו מספק גישה לתכונות מורכבות יותר כך שגישות באמצעות מחשב הופכות לשימוש נרחב וכמעט בלתי נמנע2. שיטות האינפורמטיקה של bioimage מגדילות באופן משמעותי את היעילות של ניתוח נתונים וחופשיות מהמסובייקטיביות הבלתי נמנעים ומהתטיות הפוטנציאליות של ניתוח הספירה הידנית. הביקוש המוגבר בתחום זה ושיפור כוח המחשב הובילו לפיתוח מספר רב של פלטפורמות ניתוח תמונה. חלקם זמינים באופן חופשי ומעניקים גישה לכלים שונים לביצוע ניתוח עם מחשבים אישיים. סיווג של כלי גישה פתוחה הוקמה לאחרונה3 ו מציג אייסי4 כמו תוכנה רבת עוצמה המשלבת שימושיות ופונקציונליות. יתר על כן, הקרח יש את היתרון של תקשורת עם ImageJ.
עבור משתמשים ללא מומחיות ניתוח תמונה, המכשולים העיקריים הם לבחור את הכלי המתאים בהתאם לפרמטרים בעייתיים כראוי המנגינה כי הם לעתים קרובות לא מובנים היטב. יתר על כן, זמני ההתקנה הם לעתים קרובות ארוך. אייסי מציע ממשק ידידותי למשתמש נקודה-and-לחץ בשם “פרוטוקולים” כדי לפתח זרימת עבודה על ידי שילוב כמה התוספים שנמצאו בתוך אוסף ממצה4. עיצוב מודולרי גמיש וממשק נקודת-ולחיצה להפוך את הגדרת ניתוח ריאלי עבור שאינם מתכנתים. כאן אנו מציגים זרימת עבודה בשם מנתח מבנה משנה, שפותחה בממשק של קרח, שתפקידו לנתח אותות פלורסנט בתאים סלולריים ספציפיים למדוד תכונות שונות כמו בהירות, מספר וקדי, גודל וקדי, והפצה מרחבית. זרימת עבודה זו מטפלת במספר בעיות כגון כימות הטרנסלוקציה של האות, ניתוח של תאים מזוהמים המבטא כתב פלורסנט, או ניתוח של וקדי ממבני משנה סלולריים שונים בתאים בודדים. הוא מאפשר את העיבוד הסימולטני של תמונות מרובות, ותוצאות הפלט מיוצאות לגליון עבודה המופרד בטאבים שניתן לפתוח בתוכניות גיליון אלקטרוני נפוצות.
צינור מנתח מבנה משנה מוצג באיור 1. ראשית, כל התמונות הכלולות בתיקיה שצוינה מעובדות מראש כדי לשפר את האות שלהם ליחס הרעש. שלב זה מגדיל את היעילות של השלבים הבאים ומקטין את זמן הריצה. לאחר מכן, אזורי הריבית (ROIs), המתאימים לאזורי התמונה שבהם יש לזהות את אות הפלורסנט, מזוהים ומחולקים. לבסוף, אות הפלורסנט מנותח והתוצאות מיוצאות לגליון עבודה מופרד באמצעות טאבים.
פילוח של אובייקט (זיהוי גבולות) הוא הצעד המאתגר ביותר בניתוח תמונה, והיעילות שלה קובעת את הדיוק של מדידות התא המתקבלות. האובייקטים הראשונים המזוהים בתמונה (המכונים אובייקטים ראשוניים) הם לעתים קרובות גרעינים מדימויים מוכתמים DNA (DAPI או כתמים), אם כי אובייקטים ראשוניים יכולים להיות גם תאים שלמים, חרוזים, ספאקלס, גידולים, או כל חפץ מוכתם. ברוב התמונות, התאים או הגרעינים הביולוגיים נוגעים זה בזה או חופפים הגורמים לאלגוריתמים פשוטים ומהירים להיכשל. עד היום, אין אלגוריתם אוניברסלי יכול לבצע פילוח מושלם של כל האובייקטים, בעיקר בגלל המאפיינים שלהם (גודל, צורה, או מרקם) לווסת את היעילות של פילוח5. כלי הפילוח המופצים בדרך כלל עם תוכנות מיקרוסקופית (כגון תוכנת הדמיה של המכונות המולקולריות על-ידי מכשירים מולקולריים6, או התוכנה המתקדמת בתחום המחקר של ניקון7) מבוססות בדרך כלל על טכניקות סטנדרטיות כגון התאמת מתאם, סף או פעולות מורפולוגיות. למרות היעילות במערכות בסיסיות, שיטות מוגדרות מאוד אלה מציגות במהירות מגבלות כאשר נעשה בהן שימוש בהקשרים מאתגרים ומדויקים יותר. ואכן, פילוח הוא רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים או סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת עבור ערכת נתונים גדולה. זרימת העבודה של מנתח מבנה המשנה משלבת אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה ולצורכי המשתמש. זה בעיקר מציע את האלגוריתם מבוסס סימן הפרשת הצבע8 עבור אובייקטים באשכולות מאוד. היעילות של שיטת פילוח זו מסתמכת על הבחירה של סמנים בודדים בכל אובייקט. סמנים אלה נבחרים באופן ידני ברוב הזמן כדי לקבל פרמטרים נכונים עבור פילוח מלא, המהווה זמן רב מאוד כאשר משתמשים מתמודדים עם מספר גבוה של אובייקטים. מנתח מבנה משנה מציע זיהוי אוטומטי של סמנים אלה, מתן תהליך רב מאוד יעיל פילוח. פילוח הוא, ברוב הזמן, את השלב המגביל של ניתוח תמונה והוא יכול לשנות במידה ניכרת את זמן העיבוד בהתאם לרזולוציה של התמונה, מספר האובייקטים לכל תמונה, והרמה של קיבוץ של אובייקטים. קווי צינורות טיפוסיים דורשים מספר שניות עד 5 דקות לכל תמונה במחשב שולחני רגיל. ניתוח של תמונות מורכבות יותר יכול לדרוש מחשב חזק יותר וכמה ידע בסיסי בניתוח תמונה.
הגמישות והפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחשות עם דוגמאות שונות בתוצאות הנציגים. היתרונות של זרימת עבודה זו מוצגים בעיקר באמצעות המחקר של מבני משנה גרעינית תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. מערכת ההפעלה מקבילה חוסר איזון של הומאוסטזיס החמצון לטובת חמצון והוא קשור עם רמות גבוהות של מינים חמצן תגובתי (ROS). מאז רוס לפעול כמו מולקולות איתות, שינויים בריכוז שלהם לוקליזציה subcellular להשפיע באופן חיובי או שלילי מספר עצום של מסלולים ורשתות המסדירים פונקציות פיזיולוגיות, כולל התמרה אותות, מנגנוני תיקון, ביטוי גנים, מוות תאים, והתפשטות9,10. מערכת ההפעלה היא אפוא מעורב ישירות בפתווגיות שונות (נוירוניווניות ומחלות לב וכלי דם, סרטן, סוכרת, וכו ‘), אלא גם הזדקנות תאית. לכן, פענוח ההשלכות של מערכת ההפעלה על הארגון של התא האנושי ותפקוד מהווה צעד מכריע בהבנת התפקידים של מערכת ההפעלה בתחילת ופיתוח של הפתווגיות האדם. הוא הוקם כי מערכת ההפעלה מווסת ביטוי גנים על ידי שעתוק מודולים דרך מספר גורמים שעתוק (p53, Nrf2, FOXO3A)11, אבל גם על ידי השפעה על הרגולציה של מספר תהליכים שיתוף ושלאחר ההמרה כגון שחבור חלופיים (as) של טרום rnas12,13,14. שחבור אלטרנטיבי של קידוד ראשוני התעתיקים שאינם קידוד הוא מנגנון חיוני המגביר את קיבולת הקידוד של הגנום על ידי הפקת תעתיק. כפי שהוא מבוצע על ידי מורכב מסובך גדול הנקרא מתחת לפני הזמן, המכיל כמעט 300 חלבונים ו 5 U-עשיר גרעיני קטן RNAs (UsnRNAs)15. הרכבה ספצאומין וכמו הם נשלט באופן הדוק בתאים וכמה צעדים של התבגרות מלבין מתרחשים בתוך תאים גרעיניים פחות ממברנה בשם Cajal גופים. מבני המשנה הגרעיניים הללו מאופיינים באופי הדינמי של המבנה שלהם ובקומפוזיציה שלהם, אשר מתנהלים בעיקר על ידי אינטראקציות רב-הדדיות של רכיבי ה-RNA והחלבון שלהם עם האוסף החלבונים. ניתוח של אלפי תאים עם זרימת העבודה של מנתח מבנה משנה מותר לאפיון של השפעות מעולם לא תיאר של מערכת ההפעלה על Cajal גופים. אכן, השיג נתונים מראים כי מערכת ההפעלה משנה את התגרלות של Cajal הגופים, גרימת הפצה משנה של היווצרות החלבון לתוך foci גרעיני קטן. שינוי כזה של מבנה של הגופים Cajal עלול להשפיע על ההבשלה של הספצאוחלק ולהשתתף אפנון כמו מערכת ההפעלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג’י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. היתה נתמכת על-ידי מלגת מוסמכים מבית המיניצ ‘ א-לה-שרצ’ה וטכנולוגיות עזר. L.H. היה נתמך על ידי מלגת בוגר מכון דה Cancérologie דה לוריין (כיל), בעוד שקט היה נתמך על ידי מענק ציבורי תנוהלנה על ידי סוכנות המחקר הלאומי הצרפתית (ANR) כחלק השני “הבדיקה של התוכנית” להילחם-HF (התייחסות: ANR-15-RHU4570004). עבודה זו ממומנת על ידי CNRS ואוניברסיטת דה לוריין (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
Referenzen
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
