Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência
Summary
Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.
Abstract
A última década tem sido caracterizada por avanços em técnicas de microscopia de fluorescência ilustradas pela melhoria da resolução espacial, mas também em imagens de células vivas e técnicas de microscopia de alto rendimento. Isso levou a um aumento constante na quantidade e complexidade dos dados de microscopia para um único experimento. Como a análise manual dos dados de microscopia é muito demorada, subjetiva e proíbe análises quantitativas, a automação da análise de bioimagem está se tornando quase inevitável. Construímos um fluxo de trabalho de informática chamado Substructure Analyzer para automatizar totalmente a análise de sinais em bioimagems de microscopia fluorescente. Este fluxo de trabalho é desenvolvido na plataforma de código aberto Icy e é concluído por funcionalidades do ImageJ. Inclui o pré-processamento de imagens para melhorar a relação sinal/ruído, a segmentação individual das células (detecção de limites celulares) e a detecção/quantificação de corpos celulares enriquecidos em compartimentos celulares específicos. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é propor funcionalidades complexas de bioimagem aos usuários sem experiência em análise de imagem por meio de uma interface fácil de usar. Além disso, é altamente modular e adaptado a várias questões desde a caracterização da translocação nuclear/citoplasmática até a análise comparativa de diferentes corpos celulares em diferentes subescobrições celulares. A funcionalidade deste fluxo de trabalho é ilustrada através do estudo dos Corpos de Cajal (enrolados) sob condições de estresse oxidativo (OS). Dados da microscopia de fluorescência mostram que sua integridade em células humanas é impactada poucas horas após a indução do SO. Este efeito é caracterizado pela diminuição da nucleação de coilina em corpos característicos de Cajal, associados a uma redistribuição nucleoplasmática de coilina em um número aumentado de focos menores. O papel central da coilina na troca entre os componentes do CB e o nucleoplasma circundante sugere que a redistribuição induzida pelo SO do coilin poderia afetar a composição e a funcionalidade dos Corpos de Cajal.
Introduction
Microscopia leve e, mais particularmente, microscopia de fluorescência são técnicas robustas e versáteis comumente utilizadas em ciências biológicas. Eles dão acesso à localização precisa de várias biomoléculas como proteínas ou RNA através de sua rotulagem fluorescente específica. A última década foi caracterizada por rápidos avanços em tecnologias de microscopia e imagem, evidenciados pelo Prêmio Nobel de Química de 2014, premiando Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner pelo desenvolvimento de microscopia de fluorescência super resolvida (SRFM)1. O SFRM contorna o limite de difração da microscopia óptica tradicional para trazê-lo para a nanodimensional. A melhoria de técnicas como imagens ao vivo ou abordagens de triagem de alto rendimento também aumenta a quantidade e a complexidade dos dados para tratar para cada experimento. Na maioria das vezes, os pesquisadores se deparam com altas populações heterogêneas de células e querem analisar fenótipos no nível unicelular.
Inicialmente, análises como a contagem de focos foram realizadas por olho, o que é preferido por alguns pesquisadores, uma vez que fornece controle visual total sobre o processo de contagem. No entanto, a análise manual desses dados é muito demorada, leva à variabilidade entre observadores e não dá acesso a recursos mais complexos para que abordagens assistidas por computador estejam se tornando amplamente utilizadas e quase inevitáveis2. Os métodos de informática da bioimagem aumentam substancialmente a eficiência da análise de dados e estão livres da subjetividade inevitável do operador e do viés potencial da análise de contagem manual. O aumento da demanda neste campo e a melhoria do poder computacional levaram ao desenvolvimento de um grande número de plataformas de análise de imagens. Alguns deles estão disponíveis gratuitamente e dão acesso a várias ferramentas para realizar análises com computadores pessoais. Uma classificação de ferramentas de acesso aberto foi recentemente estabelecida3 e apresenta o Icy4 como um software poderoso que combina usabilidade e funcionalidade. Além disso, Icy tem a vantagem de se comunicar com ImageJ.
Para usuários sem experiência em análise de imagem, os principais obstáculos são escolher a ferramenta apropriada de acordo com os parâmetros problemáticos e de sintonia correta que muitas vezes não são bem compreendidos. Além disso, os tempos de configuração são muitas vezes longos. A Icy propõe uma interface de ponto e clique amigável chamada “Protocolos” para desenvolver fluxo de trabalho, combinando alguns plugins encontrados dentro de uma coleção exaustiva4. O design modular flexível e a interface point-and-click tornam a configuração uma análise viável para não-programadores. Aqui apresentamos um fluxo de trabalho chamado Substructure Analyzer,desenvolvido na interface de Icy, cuja função é analisar sinais fluorescentes em compartimentos celulares específicos e medir diferentes características como brilho, número de focos, tamanho de focos e distribuição espacial. Este fluxo de trabalho aborda várias questões como quantificação da translocação de sinal, análise de células transfeminadas expressando um repórter fluorescente ou análise de focos de diferentes subestruturas celulares em células individuais. Ele permite o processamento simultâneo de várias imagens e os resultados de saída são exportados para uma planilha delimitada por guias que podem ser abertas em programas de planilha comumente usados.
O gasoduto Analisador de Subestrutura é apresentado na Figura 1. Primeiro, todas as imagens contidas em uma pasta especificada são pré-processadas para melhorar sua relação sinal/ruído. Esta etapa aumenta a eficiência das etapas seguintes e diminui o tempo de execução. Em seguida, são identificadas e segmentadas as Regiões de Interesse (ROIs), correspondentes às áreas de imagem onde o sinal fluorescente deve ser detectado, são identificadas e segmentadas. Finalmente, o sinal fluorescente é analisado e os resultados são exportados para uma planilha delimitada por guias.
A segmentação de objetos (detecção de limites) é o passo mais desafiador na análise de imagens, e sua eficiência determina a precisão das medições celulares resultantes. Os primeiros objetos identificados em uma imagem (chamados objetos primários) são frequentemente núcleos de imagens manchadas de DNA (coloração DAPI ou Hoechst), embora objetos primários também possam ser células inteiras, contas, manchas, tumores ou quaisquer objetos manchados. Na maioria das imagens biológicas, células ou núcleos se tocam ou se sobrepõem fazendo com que os algoritmos simples e rápidos falhem. Até o momento, nenhum algoritmo universal pode realizar a segmentação perfeita de todos os objetos, principalmente porque suas características (tamanho, forma ou textura) modulam a eficiência da segmentação5. As ferramentas de segmentação comumente distribuídas com software de microscopia (como o MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, ou o NIS-Elements Advances Research software by Nikon7) são geralmente baseadas em técnicas padrão, como correspondência de correlação, limiar ou operações morfológicas. Embora eficientes em sistemas básicos, esses métodos supergeralizados rapidamente apresentam limitações quando utilizados em contextos mais desafiadores e específicos. De fato, a segmentação é altamente sensível a parâmetros experimentais, como tipo de célula, densidade celular ou biomarcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. O fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura integra algoritmos simples e mais sofisticados para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário. Ele propõe notavelmente o algoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcador8 para objetos altamente agrupados. A eficiência deste método de segmentação depende da seleção de marcadores individuais em cada objeto. Esses marcadores são escolhidos manualmente na maior parte do tempo para obter parâmetros corretos para a segmentação completa, o que é altamente demorado quando os usuários enfrentam um alto número de objetos. O Analisador de Subestrutura propõe uma detecção automática desses marcadores, proporcionando um processo de segmentação altamente eficiente. A segmentação é, na maioria das vezes, a etapa limitante da análise de imagens e pode modificar consideravelmente o tempo de processamento dependendo da resolução da imagem, do número de objetos por imagem e do nível de agrupamento de objetos. Os dutos típicos requerem alguns segundos a 5 minutos por imagem em um computador de mesa padrão. A análise de imagens mais complexas pode exigir um computador mais poderoso e alguns conhecimentos básicos em análise de imagens.
A flexibilidade e funcionalidade deste fluxo de trabalho são ilustradas com vários exemplos nos resultados representativos. As vantagens deste fluxo de trabalho são notavelmente demonstradas através do estudo de subestruturas nucleares sob condições de estresse oxidativo (OS). O OS corresponde a um desequilíbrio da homeostase redox em favor dos oxidantes e está associado a altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a ROS atua como moléculas de sinalização, as mudanças em sua concentração e localização subcelular afetam positiva ou negativamente uma miríade de vias e redes que regulam funções fisiológicas, incluindo transdução de sinais, mecanismos de reparação, expressão genética, morte celular e proliferação9,,10. Assim, a OS está diretamente envolvida em diversas patologias (doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, cânceres, diabetes, etc.), mas também no envelhecimento celular. Portanto, decifrar as consequências da OS na organização e função da célula humana constitui um passo crucial na compreensão dos papéis da OS no início e desenvolvimento das patologias humanas. Foi estabelecido que o OS regula a expressão genética através da modulação da transcrição através de vários fatores de transcrição (p53, Nrf2, FOXO3A)11, mas também afetando a regulação de vários processos co e pós-transcrição, como o emenda alternativa (AS) das pré-RNAs12,,13,,14. O splicing alternativo de codificação primária e transcrições não codificadas é um mecanismo essencial que aumenta a capacidade de codificação dos genomas produzindo isoformas de transcrição. O AS é realizado por um enorme complexo de ribonucleoproteína chamado emenda ao esfarmato, contendo quase 300 proteínas e 5 pequenas RNAs nucleares (UsnRNAs)15. A montagem de spliceosome e as são fortemente controladas em células e alguns passos da maturação de emendas ocorrem dentro de compartimentos nucleares sem membrana chamados Corpos de Cajal. Essas subestruturas nucleares são caracterizadas pela natureza dinâmica de sua estrutura e sua composição, que são conduzidas principalmente por interações multivalentes de seus componentes de RNA e proteína com a proteína coilina. A análise de milhares de células com o fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura permitiu a caracterização de efeitos nunca descritos do SO em Corpos de Cajal. De fato, dados obtidos sugerem que o OS modifica a nucleação dos Corpos de Cajal, induzindo uma redistribuição nucleoplasmática da proteína coilin em numerosos focos nucleares menores. Tal mudança na estrutura dos Corpos de Cajal pode afetar o amadurecimento do emenda e participar da modulação de AS pela OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um número crescente de ferramentas de software livre estão disponíveis para a análise de imagens celulares de fluorescência. Os usuários devem escolher corretamente o software adequado de acordo com a complexidade de sua problemática, com seus conhecimentos em processamento de imagem e com o tempo que desejam passar em suas análises. Icy, CellProfiler ou ImageJ/Fiji são ferramentas poderosas que combinam usabilidade e funcionalidade3. O Icy é uma ferramenta autônoma que apresenta uma in…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação da Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), enquanto Q.T. foi apoiado por uma bolsa pública supervisionada pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) como parte do segundo programa “Investissements d’Avenir” FIGHT-HF (referência: ANR-15-RHU4570004). Este trabalho foi financiado pelo CNRS e pela Université de Lorraine (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
Referenzen
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