הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans
Summary
כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה לא רדיואקטיבית ולא פולשנית כדי להעריך סינתזת חלבון דה נובו ב vivo, ניצול elegans caenorhabditis נמטודה והתאוששות פלואורסצנציה לאחר photobleaching (FRAP). שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מסכים גנטיים ו/או תרופתיים כדי לזהות אפנונים חדשניים של סינתזת חלבונים.
Abstract
שמירה על פרוטאום בריא חיוני עבור תא והומטזיס אורגני. אידיאום האיזון בין שליטה תרגום חלבון והשפלה תירגם מספר רב של מחלות הקשורות לגיל. ירידה של מנגנוני בקרת איכות proteostasis הוא סימן ההיכר של הזדקנות. שיטות ביוכימיות לזיהוי סינתזת חלבון דה נובו עדיין מוגבלות, יש מספר חסרונות ולא ניתן לבצע בתאים חיים או בעלי חיים. Caenorhabditis elegans, להיות שקוף ומהונדס גנטית בקלות, הוא מודל מצוין כדי לפקח על שיעורי סינתזת חלבון באמצעות טכניקות הדמיה. כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה למדוד סינתזת חלבון דה נובו ב vivo ניצול התאוששות פלואורסצנט לאחר פוטובלאצ’י (FRAP). בעלי חיים טרנסגניים המביעים חלבוני פלורסנט בתאים או ברקמות ספציפיים מופרים על ידי מקור אור רב עוצמה וכתוצאה מכך פוטו-בליח פלואורסצנטי. בתורו, הערכה של התאוששות פלואורסץ מסמל סינתזת חלבון חדשה בתאים ו / או רקמות של עניין. לפיכך, השילוב של נמטודות טרנסגנית, התערבויות גנטיות ו/או פרמקולוגיות יחד עם הדמיה חיה של שיעורי סינתזת חלבונים יכול לשפוך אור על מנגנונים בתיווך קריסת פרוטאוסטזיס תלויי גיל.
Introduction
סינתזת חלבון והשפלה חיוניים להומיאוסטזיס אורגני. מספר רב של מחלות הקשורות לגיל הם יזם על ידי ייצור חלבון פגום1,,2. על מנת למדוד את שיעורי תרגום חלבון גלובליים, ישנן טכניקות ביוכימיות כגון פרופיל ריבוזומאל, אשר כרוך רצף עמוק של שברי mRNA מוגן ריבוזום כדי לפקח על הביטוי, כמו גם סינתזת חלבון רומן3. שיטה זו, מלבד היותו קריאה עקיפה של שיעורי תרגום, כמו שיוך RNA מוגברת לriבוזומים לא בהכרח אומר תרגום מוגבר, יש חסרונות טכניים, כגון עלות גבוהה ודרישה של כמות גדולה של חומר התחלה. מצד שני, שיטות מבוססות פרוטאומיקה מאפשרות כימות חלבון ישיר על ידי פרופיל חילוף החומרים של הדופק ואחריו ניתוח ספקטרומטריהמסה 4,5. עם זאת, זוהי גישה חצי כמותית עם רזולוציה זמנית מוגבלת שלא ניתן להשתמש בה בקלות ב-vivo. יתר על כן, תיוג של החלבון יכול להיות מופץ באופן לא שווה בבעלי חיים / רקמה של עניין. חשוב לציין, שתי שיטות אלה יכולות להסתיר וריאציות ספציפיות לרקמות או ספציפיות לתא בשיעורי תרגום חלבונים בבעלי חיים או ברקמות שלמים, בהתאמה.
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל קל לשימוש שניתן לגדול במספרים גדולים6. בנוסף, היכולת הגנטית והשקיפות שלה מאפשרות הדמיה חיה ב-vivo. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה כדי לזהות שיעורי סינתזת חלבון באמצעות התאוששות פלואורסצנט לאחר פוטו-בליסינג (FRAP). אנו מנצלים את הביטוי הטרנסגני של חלבוני פלורסנט, או בכל האורגניזם או ברקמות/תאים ספציפיים. בעלי חיים טרנסגניים עשויים גם לבטא GFP באמצעות היזם של גן, אשר מבוטא באופן נרחב / גלובלי או מקדם ספציפי לרקמות כדי למקד סוגי תאים ספציפיים. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת יזם ספציפי כדי לבחון את שיעורי סינתזת חלבון של חלבון מסוים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפנון סינתזה חלבון חיוני עבור הומיאוסטזיס אורגני. במהלך ההזדקנות, סינתזת חלבון גלובלית, כמו גם ספציפית הוא מוטרד. מחקרים שנעשו לאחרונה חושפים את העובדה שאיזון תרגום חלבונים שולט ישירות בסנסנס והזדקנות אינו רק תוצר לוואי של תהליך ההזדקנות. בפרט, רכיבים מרכזיים של מכונות התרגום כגון גורם ח?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחאניוטקיס מ. וקונאקיס ק. על הקלטת וידאו ועריכה. K.P. ממומנת על ידי מענק מהקרן ההלנית למחקר וחדשנות (HFRI) והמזכירות הכללית למחקר וטכנולוגיה (GSRT). N.T. ממומן על ידי מענקים ממועצת המחקר האירופית (ERC – GA695190 – MANNA), תוכניות מסגרת הנציבות האירופית, ומשרד החינוך היווני.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referenzen
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetik. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
