Valutazione dei tassi di sintesi proteica de novo in Caenorhabditis elegans
Summary
Qui, introduciamo e descriviamo un metodo nonradioattivo e non invasivo per valutare la sintesi proteica de novo in vivo, utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans e il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Questo metodo può essere combinato con schermi genetici e/o farmacologici per identificare nuovi modulatori della sintesi proteica.
Abstract
Mantenere un proteoma sano è essenziale per l’omeostasi cellulare e organismosa. La perturbazione dell’equilibrio tra il controllo traslazione proteica e la degradazione istiga una moltitudine di malattie legate all’età. Il declino dei meccanismi di controllo della qualità della proteostasi è un segno distintivo dell’invecchiamento. I metodi biochimici per rilevare la sintesi proteica de novo sono ancora limitati, presentano diversi svantaggi e non possono essere eseguiti in cellule o animali vivi. Caenorhabditis elegans, essendo trasparente e facilmente geneticamente modificato, è un ottimo modello per monitorare i tassi di sintesi delle proteine utilizzando tecniche di imaging. Qui, introduciamo e descriviamo un metodo per misurare la sintesi proteica de novo in vivo utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Gli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule o tessuti specifici sono irradiati da una potente fonte di luce con conseguente fotobleaching della fluorescenza. A sua volta, la valutazione del recupero della fluorescenza significa nuova sintesi proteica nelle cellule e/o nei tessuti di interesse. Pertanto, la combinazione di nematodi transgenici, interventi genetici e/o farmacologici insieme all’imaging dal vivo dei tassi di sintesi proteica può far luce sui meccanismi che mediano il collasso della proteostasi dipendente dall’età.
Introduction
La sintesi e la degradazione delle proteine sono essenziali per l’omeostasi dell’organismo. Una moltitudine di malattie legate all’età sono istigate dalla produzione di proteinedifettose 1,2. Al fine di misurare i tassi di traduzione globale delle proteine, esistono tecniche biochimiche come la profilazione ribosomica, che prevede il sequenziamento profondo dei frammenti di mRNA protetti da riboso per monitorare l’espressione e la sintesi delle proteine3. Questo metodo, oltre ad essere una lettura indiretta dei tassi di traslazione, poiché una maggiore associazione dell’RNA ai ribosomi non significa necessariamente una maggiore traduzione, presenta svantaggi tecnici, come l’alto costo e il requisito di una grande quantità di materiale iniziale. D’altra parte, i metodi basati sulla proteomica consentono la quantificazione diretta delle proteine mediante profilazione metabolica dell’impulso seguita dall’analisi della spettrometriadi massa 4,5. Tuttavia, si tratta di un approccio semi-quantitativo con risoluzione temporale limitata che non può essere facilmente utilizzato in vivo. Inoltre, l’etichettatura della proteina può essere distribuita in modo ineguale nell’animale/tessuto di interesse. È importante sottolineare che entrambi questi metodi possono nascondere variazioni specifiche del tessuto o delle cellule nei tassi di conversione delle proteine rispettivamente in animali o tessuti interi.
Caenorhabditis elegans è un organismo modello facile da usare che può essere coltivato in grandi numeri6. Inoltre, la sua capacità genetica e la trasparenza consentono l’imaging dal vivo in vivo. Questo protocollo descrive la metodologia per rilevare i tassi di sintesi proteica utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Approfittiamo dell’espressione transgenica delle proteine fluorescenti, sia nell’intero organismo che in tessuti/cellule specifici. Gli animali transgenici possono esprimere GFP usando il promotore di un gene, che è ampiamente/globalmente espresso o un promotore specifico del tessuto per colpire tipi di cellule specifiche. Questa tecnica può essere estesa a un promotore specifico per esaminare i tassi di sintesi proteica di una proteina specifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulazione della sintesi proteica è essenziale per l’omeostasi organismosa. Durante l’invecchiamento, la sintesi proteica globale e specifica è perturbata. Recenti studi rivelano che l’equilibrio della traduzione delle proteine controlla direttamente la senescenza e l’invecchiamento non è solo un sottoprodotto del processo di invecchiamento. In particolare, componenti fondamentali del macchinario di traduzione come il fattore di iniziazione eucariotica 4E (eIF4E), che facilita il limite dell’mRNA durante l’iniziaz…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione e l’editing video. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l’innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziato da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell’istruzione.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referenzen
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- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
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