Quantificazione in vivo del fatturato proteico nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Dendra2 fotoconvertibile
Summary
Presentato qui è un protocollo per monitorare la degradazione della proteina huntingtina fusa al fluoroforo fotoconvertibile Dendra2.
Abstract
Le proteine sono sintetizzate e degradate costantemente all’interno di una cellula per mantenere l’omeostasi. Essere in grado di monitorare la degradazione di una proteina di interesse è fondamentale per comprendere non solo il suo ciclo di vita, ma anche per scoprire gli squilibri nella rete proteostasi. Questo metodo mostra come monitorare la degradazione della proteina huntingtina che causa la malattia. Due versioni di huntingtina fusa a Dendra2 sono espresse nel sistema nervoso C. elegans: una versione fisiologica o una con un tratto espanso e patogeno di glutammine. Dendra2 è una proteina fluorescente fotoconvertibile; su un breve impulso ultravioletto di irradiazione (UV), Dendra2 commuta i suoi spettri di eccitazione/emissione dal verde al rosso. Simile a un esperimento di pulse-chase, il turnover del red-Dendra2 convertito può essere monitorato e quantificato, indipendentemente dall’interferenza da nuovo sintetizzato verde-Dendra2. Utilizzando la microscopia a base confocale e grazie alla trasparenza ottica di C. elegans,è possibile monitorare e quantificare la degradazione della huntingtina-Dendra2 in un organismo vivente e invecchiato. La huntingtina-Dendra2 neuronale è parzialmente degradata subito dopo la conversione e cancellata ulteriormente nel tempo. I sistemi che controllano la degradazione sono carenti in presenza di huntingtina mutata e sono ulteriormente compromessa dall’invecchiamento. I sottotipi neuronali all’interno dello stesso sistema nervoso presentano diverse capacità di turnover per huntingtina-Dendra2. Nel complesso, il monitoraggio di qualsiasi proteina di interesse fusa in Dendra2 può fornire informazioni importanti non solo sul suo degrado e sugli attori della rete proteostasis coinvolti, ma anche sulla sua posizione, traffico e trasporto.
Introduction
Il proteoma di un organismo vivente si rinnova costantemente. Le proteine sono continuamente degradate e sintetizzate in base alla domanda fisiologica di una cellula. Alcune proteine vengono rapidamente eliminate, mentre altre sono più vissute. Il monitoraggio delle dinamiche delle proteine è un compito più semplice, più accurato e meno invasivo quando si utilizzano proteine fluorescenti geneticamente codificate (FP). Le FP si formano automaticamente e possono essere fuse in qualsiasi proteina di interesse (POI), ma non richiedono enzimi per piegare o hanno bisogno di cofattori risparmiano perl’ossigeno 1. Una nuova generazione di SP è stata recentemente progettata per cambiare colore all’irradiazione con un impulso luminoso di lunghezza d’onda determinata. Questi FP fotoattivabili (PAFP) consentono l’etichettatura e il tracciamento dei POI, o degli organelli o delle cellule in cui risiedono, e di esaminare i loro parametri quantitativi e/o qualitativi2. Gli FP consentono di tracciare qualsiasi movimento, direzionalità, tasso di locomozione, coefficiente di diffusione, frazioni mobili o frazioni immobili, il tempo in cui risiede in un vano cellulare, nonché il suo tasso di avvicendamento. Per organelli specifici, è possibile determinare eventi di fissione e fusione. Per un particolare tipo di cella, è possibile stabilire la posizione di una cella, la velocità di divisione, il volume e la forma. Fondamentalmente, l’uso di PAFP consente il monitoraggio senza visualizzazione continua e senza interferenze da qualsiasi sonda appena sintetizzata. Studi sia nelle cellule che in organismi interi hanno impiegato con successo PAFP per affrontare questioni biologiche in vivo, come lo sviluppo di cancro e metastasi, l’assemblaggio o lo smontaggio del citoscheletro e le interazioni RNA-DNA/proteina3. In questo manoscritto, la microscopia leggera e i PAFP sono utilizzati per scoprire i tassi di rotazione della huntingtina proteica incline all’aggregazione (HTT) in vivo in un modello C. elegans della malattia neurodegenerativa.
Il protocollo qui descritto quantifica la stabilità e la degradazione della proteina di fusione huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 è un PAFP4 monomerico di seconda generazione che cambia irreversibilmente i suoi spettri di emissione/eccitazione dal verde al rosso in risposta ai raggi UV o alla luce blu visibile, con un aumento della sua intensità fino a 4.000-fold5,6. L’huntingtina è la proteina responsabile della malattia di Huntington (HD), un disturbo neurodegenerativo ereditario fatale. Huntingtina exon-1 contiene un tratto di glutammine (CAG, Q). Quando la proteina è espressa con oltre 39Q, si trasforma male in una proteina mutante, tossica e patogena. Mutant HTT è incline all’aggregazione e porta alla morte e degenerazione delle cellule neuronali, sia come specie oligomeriche corte o come amiloidi altamente strutturati più grandi7 .
Il nematode è un sistema modello per studiare l’invecchiamento e la neurodegenerazione grazie alla sua facilità di manipolazione, natura isogenica, breve durata di vita e la sua trasparenza ottica8. Per studiare la stabilità dell’HTT in vivo, un costrutto di fusione è stato espresso nel sistema nervoso di C. elegans. Un transgene HTT-D2 contenente un tratto fisiologico di 25Q (HTTQ25-D2) o un tratto patologico di 97Q (HTTQ97-D2) è sovraespresso pan-neuronalmente per tutta la durata del nematode9. Sottoponendo C. elegans dal vivo a un breve e concentrato punto di luce, un singolo neurone viene commutato foto e l’HTT-D2 convertito viene tracciato nel tempo. Per stabilire la quantità di HTT-D2 degradata, la differenza tra il segnale rosso dell’HTT-D2 appena convertito viene confrontata con il segnale rosso rimanente di HTT-D2 dopo un determinato periodo di tempo. Pertanto, diventa possibile studiare come la huntingtina viene degradata quando si trova nella sua forma espansa e tossica rispetto alla sua forma fisiologica; come i neuroni anteriori o posteriori rispondono in modo diverso alla presenza di Q97 rispetto al Q25, specialmente in periodi di tempo prolungati; e come il collasso della rete proteostasi (PN) durante l’invecchiamento contribuisca alle differenze nei tassi di degradazione. Questi risultati descrivono solo una piccola serie di osservazioni sul fatturato di HTT-D2. Tuttavia, molte altre questioni biologiche rilevanti sia per il campo dell’aggregazione proteica che per la proteostasi possono essere affrontate con questa applicazione in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per comprendere la funzione di una proteina è importante comprenderne la sintesi, la posizione e la degradazione. Con lo sviluppo di FP nuovi, stabili e luminosi, la visualizzazione e il monitoraggio dei POI sono diventati più facili ed efficienti. I PAFP di fusione geneticamente espressi come Dendra2 sono posizionati in modo univoco per studiare la stabilità di un POI. Dopo l’esposizione alla luce viola-blu, Dendra2 si rompe in una posizione precisa all’interno di una triade di aminoacidi conservati. Il fluoroforo su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, borsa di dottorato NeuroCure dal Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l’Imaging Core Facility dell’Istituto di ricerca Leibniz per la farmacologia molecolare di Berlino (FMP) per aver fornito l’imaging creato. Inoltre, vorremmo ringraziare Diogo Feleciano che ha stabilito il sistema Dendra2 in laboratorio e ha fornito istruzioni.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
Referenzen
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemie. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
