In Vivo Quantificação do Volume de Negócios de Proteínas no Envelhecimento C. Elegans usando Dendra2 Fotoconvertível
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para monitorar a degradação da proteína huntingtin fundida ao fluorohore fotoconvertível Dendra2.
Abstract
As proteínas são sintetizadas e degradadas constantemente dentro de uma célula para manter a homeostase. Ser capaz de monitorar a degradação de uma proteína de interesse é fundamental para entender não apenas seu ciclo de vida, mas também para descobrir desequilíbrios na rede de proteostase. Este método mostra como rastrear a degradação da inseção de proteínas causadoras de doenças. Duas versões de huntingtin fundidas a Dendra2 são expressas no sistema nervoso C. elegans: uma versão fisiológica ou uma com um trecho expandido e patogênico de glutaminas. Dendra2 é uma proteína fluorescente fotoconvertível; após um pulso de irradiação ultravioleta curto (UV), o Dendra2 muda seu espectro de excitação/emissão de verde para vermelho. Semelhante a um experimento de perseguição de pulso, o volume de negócios do Convertido red-Dendra2 pode ser monitorado e quantificado, independentemente da interferência do recém-sintetizado green-Dendra2. Utilizando microscopia baseada em confocal e devido à transparência óptica de C. elegans,é possível monitorar e quantificar a degradação da huntingtin-Dendra2 em um organismo vivo e envelhecido. A caça neuronaltin-Dendra2 é parcialmente degradada logo após a conversão e liberada mais ao longo do tempo. Os sistemas que controlam a degradação são deficientes na presença de caça mutante e são ainda mais prejudicados com o envelhecimento. Subtipos neuronais dentro do mesmo sistema nervoso apresentam diferentes capacidades de rotatividade para huntingtin-Dendra2. No geral, o monitoramento de qualquer proteína de interesse fundida à Dendra2 pode fornecer informações importantes não apenas sobre sua degradação e os atores da rede de proteostase envolvida, mas também sobre sua localização, tráfico e transporte.
Introduction
O proteome de um organismo vivo está constantemente se renovando. As proteínas são continuamente degradadas e sintetizadas de acordo com a demanda fisiológica de uma célula. Algumas proteínas são rapidamente eliminadas, enquanto outras são mais vividas. Monitorar a dinâmica proteica é uma tarefa mais simples, mais precisa e menos invasiva ao usar proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs). Os FPs formam-se autocatalyticamente e podem ser fundidos a qualquer proteína de interesse (POI), mas não requerem enzimas para dobrar ou precisam de cofatores para economizar oxigênio1. Uma nova geração de FPs foi recentemente projetada para mudar de cor após a irradiação com um pulso leve de determinado comprimento de onda. Esses FPs fotoativados (PAFPs) permitem a rotulagem e rastreamento de POIs, ou as organelas ou células em que residem, e examinar seus parâmetros quantitativos e/ou qualitativos2. Os FPs possibilitam rastrear qualquer movimento, direcionalidade, taxa de locomoção, coeficiente de difusão, frações móveis versus imóveis, o tempo em que reside em um compartimento celular, bem como sua taxa de rotatividade. Para organelas específicas, podem ser determinadas atividades de locomoção e transporte, ou eventos de fissão e fusão. Para um determinado tipo de célula, a posição de uma célula, a taxa de divisão, o volume e a forma podem ser estabelecidos. Crucialmente, o uso de PAFPs permite o rastreamento sem visualização contínua e sem interferência de qualquer sonda recém-sintetizada. Estudos tanto em células quanto em organismos inteiros têm utilizado com sucesso PAFPs para abordar questões biológicas in vivo, como o desenvolvimento de câncer e metástase, montagem ou desmontagem do citoesqueleto, e interações RNA-DNA/proteína3. Neste manuscrito, microscopia leve e PAFPs são usados para descobrir as taxas de rotatividade da caça de proteínas propensas à agregação (HTT) in vivo em um modelo C. elegans de doença neurodegenerativa.
O protocolo aqui descrito quantifica a estabilidade e a degradação da proteína de fusão huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 é um PAFP4 monomédico de segunda geração que muda irreversivelmente seu espectro de emissão/excitação de verde para vermelho em resposta à luz azul UV ou visível, com um aumento em sua intensidade de até 4.000vezes 5,6. Huntingtin é a proteína responsável por causar a doença de Huntington (HD), uma doença neurodegenerativa hereditária fatal. Huntingtin exon-1 contém um trecho de glutaminas (CAG, Q). Quando a proteína é expressa com mais de 39T, ela se dobra em uma proteína mutante, tóxica e patogênica. O HTT mutante é propenso à agregação e leva à morte e degeneração celular neuronal, seja como espécies oligomericas curtas ou como amiloides altamente estruturados7.
O nematoide é um sistema modelo para estudar o envelhecimento e a neurodegeneração graças à sua facilidade de manipulação, natureza isogênica, vida útil curta e sua transparência óptica8. Para estudar a estabilidade do HTT in vivo, uma construção de fusão foi expressa no sistema nervoso de C. elegans. Um transgene HTT-D2 contendo um trecho fisiológico de 25Qs (HTTQ25-D2) ou um trecho patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) é superexpresso pan-neuronalmente durante toda a vida do nematodo9. Ao submeter C. elegans ao vivo a um breve e focado ponto de luz, um único neurônio é fotowitched e o HTT-D2 convertido é rastreado ao longo do tempo. Para estabelecer a quantidade de HTT-D2 degradada, a diferença entre o sinal vermelho do HTT-D2 recém-convertido é comparada com o sinal vermelho restante de HTT-D2 após um determinado período de tempo. Portanto, torna-se possível investigar como a cantina é degradada quando encontrada em sua forma expandida e tóxica em comparação com sua forma fisiológica; como os neurônios anteriores ou posteriores respondem de forma diferente à presença do Q97 versus Q25, especialmente em períodos de tempo prolongados; e como o colapso da rede de proteostase (PN) durante o envelhecimento contribui para as diferenças nas taxas de degradação. Estes resultados descrevem apenas um pequeno conjunto de observações sobre o volume de negócios do HTT-D2. No entanto, muitas outras questões biológicas relevantes tanto para o campo da agregação de proteínas quanto para a proteostase podem ser abordadas com essa aplicação in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para compreender a função de uma proteína é importante entender sua síntese, localização e degradação. Com o desenvolvimento de FPs novos, estáveis e brilhantes, visualizar e monitorar POIs tornou-se mais fácil e eficiente. PAFPs de fusão geneticamente expressos como o Dendra2 estão posicionados exclusivamente para estudar a estabilidade de um POI. Após a exposição à luz azul-roxa, Dendra2 quebra em um local preciso dentro de uma tríade de aminoácidos conservados. O fluoróforo sofre uma pequena mudan?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 à JK, bolsa de doutorado da NeuroCure pelo NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) para financiamento. Também reconhecemos a Instalação do Núcleo de Imagens do Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) por fornecer a configuração de imagens. Além disso, gostaríamos de agradecer a Diogo Feleciano que estabeleceu o sistema Dendra2 no laboratório e forneceu instruções.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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