利用浊度和血栓成形术进行补充血栓表征

Summary

纤维蛋白负责血栓形成期间血栓和血栓形成。浊度测定和血栓（TEG）可作为协同工具，提供血栓的补充评估。这两种技术可以更深入地了解凝血条件如何影响纤维蛋白凝块的形成。

Abstract

血栓形成是全世界的主要死因。纤维蛋白（原体）是主要负责凝块形成或血栓形成的蛋白质。因此，血栓形成特征有利于血栓形成的研究。浊度和血栓成形术（TEG）在体外测定中被广泛用于监测血块的形成。浊度通过光谱仪通过纤维蛋白血块结构动态测量光透光，并常用于研究实验室。TEG 是一种专门性粘弹性技术，可直接测量血栓强度，主要用于临床环境评估患者的血栓。在这两种工具的帮助下，本研究描述了一种使用简化的纤维蛋白/血栓表图来描述体外纤维蛋白血块的方法。比较了两种技术在各种凝血条件下的数据趋势。在这项研究中，由于牛凝血因子在临床和研究环境中经常被用作人类凝血因子的替代品，因此人类纤维蛋白血块是并排形成的。结果表明，TEG和浊度通过两种不同的方法跟踪凝块的形成，并结合使用，可跨不同的凝块条件提供互补的血块强度和纤维结构信息。

Introduction

血栓形成是体内血块的病理形成，它阻止血液循环，导致全球发病率和死亡率高。每年每1000人有1至2例静脉血栓栓塞，每千人有2至3例血栓引起的血管^1,疾病。这里介绍的方法是利用血栓成形术（TEG）和浊度监测各种凝块条件下的凝块形成。纤维蛋白（原生）是导致体内凝块形成的主要蛋白质。在凝固级联的最后步骤中，纤维蛋白肽通过血栓从纤维蛋白原中切开，随着血块^{的发育，,}开始聚合不溶性纤维蛋白单^体。为了了解病理血栓形成中的血栓形成，有必要对多种凝血环境下的纤维蛋白形成进行表征。利用多种血块监测测定方法研究体外纤维蛋白血块的形成。蛋白素时间（PT/INR）和激活部分血栓铂时间（aPTT）是测量特定凝血通路完整性的两种常见临床检测方法。然而，他们使用时间作为唯一的变量，没有给出物理凝块属性⁵的指示。电子显微镜允许可视化完全形成的纤维蛋白血块的微观结构，但没有提供有关血块形成过程本身^{的信息6。}在所有测定中，浊度测定和 TEG 能够动态跟踪凝块特性。这些技术能够测量全面的凝血剖面，因此，与其他纤维蛋白凝块特性工具具有一些益处。

具体来说，浊度测定（或凝块浊度测定）由于其简单化实施和在研究实验室中广泛可访问的光谱仪，被广泛用于研究和临床应用。此测定允许通过形成块进行动态测量，以定义的波长（最常见的波长在 350 ~ 700 nm）⁷中进行单独的重复读数。也可以调整读取室中的温度。随着纤维蛋白凝胶的形成，通过蛋白质网络的光量会减少，从而随时间增加吸收度。同样，当血块网络退化时，吸光度会降低。使用多孔板格式可以轻松进行浊度测定，以便对 96 孔和 384 孔板进行高通量样品筛选。有几个凝块特征可以从浊度跟踪曲线（随着时间的推移测量的吸收度）中得出，其中包括：最大浊度、最大浊度时间、凝块发作时间以及血块形成率（Vmax）。纤维蛋白纤维质量/长度比也可以从原始浊度数据中得出，以估计纤维素纤维厚度^{8,8，9，10。,10}

TEG主要用于临床环境，以评估患者的血栓和血块解。它也常用于外科应用，以确定何时应施用抗纤维化药物或止血性血液制品^{11，12。11,}在检测开始之前，在 TEG 杯内发生凝块形成，所有凝块成分被添加到杯中。杯子，随着血块的不断演变，物理旋转对插入其中心的针脚和机电躯干传感器测量增加的粘弹性强度的血块。这种测定通常在37°C的生理温度下进行;但是，可以手动调整仪器上的温度。最大振幅 （MA）、反应速率 （R）、动力学时间 （K）、α 角度 （角度） 和最大振幅时间 （TMA） 由 TEG 软件从动态 TEG 跟踪中提取。这些值通常与临床正常范围进行比较，以评估患者的凝固状态。虽然TEG不是一个粘度计，因为它测量凝块强度以毫米单位，它确实提供了重要的粘弹性凝块数据和功能作为一个有价值的临床决策工具，医生决定管理特定的血液制品和调整治疗剂量^13。当 TEG 和浊度测定同时使用时，它们提供互补的凝块特性信息，因为凝块强度和动力学很容易从 TEG 中提取，而纤维蛋白纤维厚度可通过光学浊度测量获得。

由于纤维蛋白是血块的关键成分，在不同血块形成条件下的纤维蛋白血块表征可以提供有价值的见解，了解特定变量如何有助于血块形成过程和最终血块特性。了解这一点可以为血栓形成诊断和治疗的发展提供指导。为了获得更具代表性的纤维蛋白血块表征，可以替代等离子体来监测血块的形成，因为它与简化的纤维蛋白原/血栓模型系统更类似于体内凝血条件。然而，由于凝固级联的复杂性，使用等离子体形成的凝块增加了复杂性，使得分离单个因素的影响更加困难。利用简化的纤维蛋白原/血栓模型可防止启动整个凝血级联，从而隔离最终的纤维蛋白形成步骤。通过包括两个主要的纤维蛋白形成成分（纤维蛋白原和血栓，此设置创造了一个高度控制的凝块形成条件。还必须注意，虽然此处使用简化的凝块模型，但该协议也可用于通过包括其他凝块因子来描述更复杂的凝块。在这项研究中，使用浊度和TEG进行纤维蛋白凝块表征，通过不同的纤维蛋白原和血栓基浓度、离子强度、pH和凝血溶液中的总蛋白浓度进行，以模拟体内凝血情况^14。有关协议这些变体的详细信息已列入第 5 节。

Protocol

1. 磷酸盐缓冲液盐水（PBS）的制备 注：PBS在整个研究中被使用，因为所述的测定不需要添加钙。需要注意的是，在添加钙（通常用于重新钙化血液制品）时，应避免使用PBS，因为钙在磷酸盐缓冲液中沉淀。 在 DI 水中混合 137 mM 氯化钠、1.8 mM 磷酸钾单基、10 mM 磷酸钠二基和 2.7 mM 氯化钾，制成 0.01 M、pH 7.4 PBS 缓冲液。 使用 pH 探头验证缓冲 pH 值，并根据需要使?…

Representative Results

图 1所示的实验是不同 纤维蛋白水平的人类和牛纤维蛋白血块的代表性浊度跟踪曲线。图2显示了不同纤维蛋白原水平纤维蛋白凝块形成的代表性TEG 跟踪曲线。两种跟踪曲线都表明，在血块启动后一段滞后期后，血块浊度或血块振幅会随着时间的推移而增加，并在血块形成结束时关闭水平。最大凝块形成的终点值和每次测定的最大凝块形成时间用于评?…

Discussion

该协议演示了使用两种不同的凝块特性工具，使用商用组件测试简化的纤维蛋白原/血栓块模型。TEG 和浊度测定都易于进行。它们不仅提供端点血块检查，如最大血块形成（Turb^Max和 TEG^Max）和血块形成时间（Turb^时间和 TEG^时间），还评估动态血块形成过程。这使得TEG和浊度有价值的工具，凝块表征添加到替代方法，如：SEM，PT，APTT，或血栓流变，可以有复杂的实验?…

Materials

96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum	Millipore Sigma	A1653	≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153	≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma	Millipore Sigma	341573	contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma	Millipore Sigma	341578	Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride	Millipore Sigma	60130	≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P9791	≥98% purity
SevenEasy pH Meter	Mettler Toledo	S20
Sodium chloride	Millipore Sigma	71378	≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	71636	≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system	Molecular Devices	M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system	Haemonetics	07-022
Thrombin, Bovine	Millipore Sigma	605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity	Millipore Sigma	605195