Использование мутности и тромбоэластографии для дополнительной характеристики сгустка
Summary
Фибрин отвечает за образование тромбов во время гемостаза и тромбоза. Анализы турбитии и тромбоэластогры (TEG) могут быть использованы в качестве синергетический инструмент, который обеспечивает дополнительную оценку сгустка. Эти два метода вместе может дать более глубокое представление о том, как свертывание условия влияют на образование сгустка фибрина.
Abstract
Тромбоз является основной причиной смерти во всем мире. Фибрин (оген) является белок в первую очередь отвечает за образование тромбов или тромбоза. Поэтому для изучения тромбоза полезно характеризование образования фибринового сгустка. Турбичность и тромбоэластография (TEG) широко используются в пробирке анализы для мониторинга образования тромбов. Турбичность динамически измеряет передачу света через структуру сгустка фибрина через спектрометр и часто используется в исследовательских лабораториях. TEG является специализированным вязко-вязкостатический метод, который непосредственно измеряет силу сгустка крови и в первую очередь используется в клинических условиях для оценки гемостаз пациентов. С помощью этих двух инструментов, это исследование описывает метод для характеристики тромба фибрина in vitro с помощью упрощенной модели сгустка фибриногена/тромба. Тенденции данных по обоим методам сравнивались в различных условиях свертывания крови. Человеческие и бычьи сгустки фибрина были сформированы бок о бок в этом исследовании, как бычьего свертывания факторов часто используются в качестве заменителей факторов свертывания человека в клинических и научно-исследовательских условиях. Результаты показывают, что TEG и мутность отслеживать образование тромбов с помощью двух различных методов и при использовании вместе обеспечивают дополнительную силу сгустка и волокна структурной информации через различные условия свертывания.
Introduction
Тромбоз является патологическим образованием тромба в организме, который блокирует кровообращение, что приводит к высокой заболеваемости и смертности во всем мире. Есть от 1 до 2 случаев венозной тромбоэмболии и от 2 до 3 случаев тромбоза индуцированных сосудистых заболеваний на 1000человек в год 1,2. Здесь представлен метод, использующий тромбоэластографию (TEG) и мутность для мониторинга образования тромбов при различных условиях свертывания крови. Фибрин (оген) является основным белком, который отвечает за образование тромбов в организме. На заключительных этапах каскада коагуляции фибринопептиды расщепляются из фибриногена путем тромбина, инициируя полимеризацию нерастворимых мономеров фибринапомере развития тромба3,4. Чтобы понять образование тромбов при патологическом тромбозе, необходимо охарактеризовать образование фибрина при различных обстоятельствах свертывания крови. Несколько анализов мониторинга сгустка были использованы для изучения образования сгустка фибрина в пробирке. Протромбиново время (PT/INR) и активированное частичное время тромбопластина (aPTT) являются двумя общими клиническими анализами, которые измеряют целостность конкретного пути свертывания. Тем не менее, они используют время в качестве единственной переменной, которая не дает никаких указаний на физические свойствасгустка 5. Электронная микроскопия позволяет визуализировать микро-структуру полностью сформированного фибринового сгустка, но не дает никакой информации о процессе формирования тромба6. Среди всех анализов, мутность анализы и TEG предлагают возможность отслеживать характеристики сгустка динамически с течением времени. Эти методы позволяют измерять всеобъемлющие профили свертывания и, следовательно, обеспечивают некоторую выгоду по отношению к другим инструментам характеристики сгустка фибрина.
В частности, анализ мутности (или мутбиметрия сгустка) широко используется для исследований и клинического применения из-за его упрощенного внедрения и широкой доступности спектрометров в исследовательских лабораториях. Этот анализ позволяет динамическое измерение передачи света через формирование сгустка, принимая отдельные повторяющиеся показания на определенной длине волны (чаще всего на длине волны в диапазоне 350 – 700 нм)7. Температура в считывной камере также может быть скорректирована. По мере того как гель фибрина формирует, количество света которое перемещает через сеть протеина уменьшен причиняя увеличение в поглощении над временем. Аналогичным образом, абсорбт уменьшается, когда сеть сгустков ухудшается. Анализы турбити могут быть легко мультиплексированы с использованием формата мульти-хорошо пластины, чтобы обеспечить высокую пропускную способность образца скрининга в обоих 96- и 384-хорошо пластин. Несколько характеристик сгустка могут быть получены из кривой отслеживания мутности (поглощение с течением времени измерения), которые включают в себя: максимальная мутность, время до максимальной мутности, время начала сгустка, и скорость образования сгустка (Vmax). Соотношение массы/длины фибринового волокна также может быть получено из необработанных данных о мутности для оценкитолщины фибринового волокна 8,,9,,10.
TEG в первую очередь используется в клинических условиях для оценки гемостаза пациентов и лиза тромба. Он также широко используется в хирургических приложениях, чтобы определить, когда антифибринолитические препараты или гемостатические продукты кровидолжны быть введены 11,12. Образование сгустка происходит внутри чашки TEG со всеми компонентами свертывания добавляются в чашку до начала анализа. Чашка, с развивающимся сгустком, физически вращается против штифта, который вставляется в его центр, а электромеханический датчик коксиона измеряет возрастающую вязко-вязкую прочность сгустка. Этот анализ обычно проводится при физиологической температуре 37 градусов по Цельсию; однако, температура может быть вручную отрегулирована на приборе. Максимальная амплитуда (MA), скорость реакции (R), время кинетики (K), угол (угол) и время максимальной амплитуды (TMA) извлекаются программным обеспечением TEG из динамического отслеживания TEG. Эти значения обычно сравниваются с клиническими нормальными диапазонами для оценки состояния свертывания пациента. Хотя TEG не является точно вискометром, так как он измеряет прочность сгустка в миллиметровых единицах, он обеспечивает важные вязкоэлетические данные сгустка и функционирует как ценный клинический инструмент принятия решений для врачей, чтобы принять решение о введении конкретных продуктов крови и настроить терапевтическуюдозирование 13. Когда как TEG и мутность анализы используются вместе, они обеспечивают дополнительную информацию характеристики сгустка, как сила сгустка и кинетики легко извлекаются из TEG и толщины волокна фибрина могут быть доступны для оптических измерений мутности.
Поскольку фибрин является важнейшим компонентом сгустка крови, характеристика сгустка фибрина при различных условиях образования тромбов может дать ценную информацию о том, как определенная переменная способствует процессу образования тромбов и конечным свойствам сгустка. Понимание этого может обеспечить руководство для диагностики тромбоза и развития терапии. Чтобы получить более репрезентативную характеристику сгустка фибрина, плазма может быть заменена для мониторинга образования тромбов, поскольку она напоминает условия свертывания виво более тесно, чем упрощенная система модели фибриногена/тромбина. Однако из-за сложного характера каскада коагуляции образование тромбов с использованием плазмы усугубляет сложность, что затрудняет изоляцию воздействия отдельных факторов. Использование упрощенной модели фибриногена/тромбина предотвращает необходимость инициировать весь каскад свертывания, позволяющий изоляцию заключительного шага формирования фибрина. Путем включая 2 главных компонента образования fibrin (фибриноген и тромбин), эта установка создает высоки контролируемое условие образования сгустка. Важно также отметить, что, хотя упрощенная модель сгустка используется здесь, этот протокол также может быть использован для характеристики более сложных сгустков, включая дополнительные факторы свертывания. В этом исследовании, фибринового сгустка характеристики с использованием мутности и TEG проводятся путем различных концентраций фибриногена и тромбина, ионическая сила, рН, и общая концентрация белка в свертываемости раствора для имитации различных обстоятельств свертываниявиво 14. Подробная информация об этих изменениях в протоколе была включена в раздел 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует использование двух различных инструментов характеристики сгустка тестирования упрощенной модели сгустка фибриногена/тромбина с использованием коммерчески доступных компонентов. И TEG и мутность анализы легко провести. Они не только обеспечивают конечные…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ни один.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
Referenzen
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. . Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. . The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
