Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq
Summary
Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.
Abstract
Adulte diffuse Gliome weisen Inter- und Intratumorheterogenität auf. Bis vor kurzem konzentrierte sich die Mehrheit der groß angelegten molekularen Profiling-Bemühungen auf Massenansätze, die zur molekularen Klassifizierung von Hirntumoren führten. In den letzten fünf Jahren haben Einzelzellsequenzierungsansätze mehrere wichtige Merkmale von Gliomen hervorgehoben. Die meisten dieser Studien haben frische Hirntumorproben verwendet, um einzelne Zellen mit Durchflusszytometrie oder Antikörper-basierten Trennmethoden zu isolieren. In Zukunft wird die Verwendung von frisch gefrorenen Gewebeproben aus Biobanken eine größere Flexibilität für Einzelzellanwendungen bieten. Darüber hinaus wird die nächste Herausforderung mit dem Fortschreiten des Einzelzellfeldes darin bestehen, Multi-Omics-Daten entweder aus einer einzelnen Zelle oder derselben Probenvorbereitung zu generieren, um die Tumorkomplexität besser zu entschlüsseln. Daher werden einfache und flexible Protokolle, die die Datengenerierung für verschiedene Methoden wie Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und Single-Nucleus-Assay für Transposase-Accessible Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (snATAC-seq) ermöglichen, für das Feld wichtig sein.
Jüngste Fortschritte im Einzelzellbereich in Verbindung mit zugänglichen mikrofluidischen Instrumenten wie der 10-fachen Genomik-Plattform haben Einzelzellanwendungen in Forschungslabors erleichtert. Um die Heterogenität von Hirntumoren zu untersuchen, haben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung einzelner Kerne aus frischen gefrorenen Gliomen entwickelt. Dieses Protokoll führt bestehende Einzelzellprotokolle zusammen und kombiniert einen Homogenisierungsschritt, gefolgt von Filtration und puffervermittelter Gradientenzentrifugation. Die resultierenden Proben sind reine Einzelkernsuspensionen, die verwendet werden können, um Einzelkern-Genexpression und Chromatin-Zugänglichkeitsdaten aus derselben Kernpräparation zu generieren.
Introduction
Diffuse niedriggrade Gliome (LGG), der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen, sind infiltrative Neoplasmen, die häufig in der Gehirnhemisphäre auftreten. LGGs weisen sowohl inter- als auch intratumorale Heterogenität auf, die nicht nur von der Tumorpopulation, sondern auch von den nicht-malignen Zellen angetriebenwird,die an der Tumorentwicklung und -progression beteiligt sind1,2,3,4,5.
In den letzten zehn Jahren gab es eine Lawine genomischer Daten, die im Bereich der Gliome gesammelt wurden. Diese Daten stammen hauptsächlich aus Massentumorsequenzierungsstudien und haben immens zur molekularen Charakterisierung und der aktuellen Klassifizierung von Hirntumoren5,6,7,8,9,10,11beigetragen . Obwohl diese Studien die breite molekulare Landschaft im Zusammenhang mit Gliomen aufzeigten, gibt es immer noch einen enttäuschenden Mangel an Fortschritten bei der therapeutischen Intervention. Eines der Hindernisse für die Behandlungsresistenz bei Hirntumoren ist die Intratumorheterogenität. Um dieses Problem anzugehen, haben sich verschiedene Studien auf die genomische, transkriptomische, proteomische und epigenetische Heterogenität konzentriert, die in einem Tumor auf Einzelzellebene vorhanden ist12,13,14,15,16,17.
Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte technologische Fortschritte im Einzelzellbereich gegeben hat, ist einer der wichtigsten einschränkenden Faktoren die Verfügbarkeit frischer Proben, die benötigt werden, um die Zellen zu isolieren und diese Experimente durchzuführen. Um diese Einschränkung zu überwinden, gab es mehrere erfolgreiche Versuche, Assays wie snRNA-seq und snATAC-seq aus gefrorenem Gewebe durchzuführen, wobei Kerne anstelle von Zellen verwendet wurden18,19. Die meisten dieser Methoden basieren entweder auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Filtrationsstrategien. Sowohl Einzelzell- als auch Einzelkernansätze haben ihre Stärken und Nachteile. Einzelzellansätze pflegen mitochondriale Transkripte, die zwar informativ sein können, aber aufgrund ihrer hohen Häufigkeit auch die Transkriptomabdeckung reduzieren können. Einzelkernisolationsansätze eliminieren einen hohen Prozentsatz der mitochondrialen Fraktion, wodurch eine tiefergehende Abdeckung der Kerntranskripte ermöglichtwird 20.
Es gibt verschiedene kommerziell verfügbare Plattformen, die in den letzten Jahren verwendet wurden, um Einzelzellgenomikdaten zu untersuchen, einschließlich RNA-seq und ATAC-seq. Eine der bekanntesten Plattformen ist die 10x Genomics Chromium-Plattform für einzellige Genexpression und Einzelzell-ATAC-Profiling. Da die Plattform mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern arbeitet, können Ablagerungen oder Aggregate das System verstopfen, was zum Verlust von Daten, Reagenzien und wertvollen klinischen Proben führt. Daher hängt der Erfolg von Einzelzellstudien weitgehend von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.
Das Protokoll, das wir hier demonstrieren werden, ist eine leicht modifizierte Kombination der Protokolle DroNc-seq und Omni-ATAC-seq und verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, die snRNA-seq verwenden, um neurologische Störungen und neuronale Zelltypen im menschlichen Gehirn zu verstehen18,19,21,22,23,24. Das Protokoll verwendet eine Kombination aus enzymatischer /mechanischer Dissoziation gefrorener Proben, gefolgt von Filtration und Gradientenzentrifugation und ermöglicht eine schnelle und genaue Isolierung einzelner Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus dem gleichen Kernpräparat aus Hirntumorproben zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gebiet der intratumoralen Heterogenität befindet sich in einem spannenden Stadium, wobei neuartige Assays und Plattformen entwickelt werden, um das vorhandene Wissen herauszufordern und zu erweitern. Intratumorale Heterogenität ist ein entscheidender Faktor, der zum Fortschreiten der Krankheit und zur Resistenz gegen die derzeitigen Behandlungsmodalitäten bei Gliomen beiträgt28. Jüngste Studien zu Hirntumoren haben sich auf diesen wichtigen Aspektkonzentriert,indem sie einzelli…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Single Cell Open Lab (scOpenLab) am Deutschen Krebszentrum (DKFZ) für hilfreiche Gespräche. Diese Forschung wurde von der Deutschen Krebshilfe, Max-Eder-Programm Fördernummer 70111964 (S.T.) unterstützt.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
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