Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq
Summary
L’eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.
Abstract
I gliomi diffusi adulti mostrano eterogeneità inter- e intra-tumorale. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli sforzi di profilazione molecolare su larga scala si sono concentrati su approcci di massa che hanno portato alla classificazione molecolare dei tumori cerebrali. Negli ultimi cinque anni, gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno evidenziato diverse caratteristiche importanti dei gliomi. La maggior parte di questi studi ha utilizzato campioni di tumore cerebrale fresco per isolare singole cellule utilizzando la citometria a flusso o metodi di separazione basati su anticorpi. Andando avanti, l’uso di campioni di tessuto appena congelati provenienti da biobanche fornirà una maggiore flessibilità alle applicazioni a singola cellula. Inoltre, con l’avanzare del campo a singola cellula, la prossima sfida sarà quella di generare dati multi-omici da una singola cellula o dalla stessa preparazione del campione per svelare meglio la complessità del tumore. Pertanto, protocolli semplici e flessibili che consentono la generazione di dati per vari metodi come il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (snATAC-seq) saranno importanti per il campo.
I recenti progressi nel campo delle singole cellule, insieme a strumenti microfluidici accessibili come la piattaforma di genomica 10x, hanno facilitato le applicazioni a singola cellula nei laboratori di ricerca. Per studiare l’eterogeneità dei tumori cerebrali, abbiamo sviluppato un protocollo avanzato per l’isolamento di singoli nuclei da gliomi freschi congelati. Questo protocollo unisce i protocolli a cella singola esistenti e combina una fase di omogeneizzazione seguita dalla filtrazione e dalla centrifugazione a gradiente mediata dal buffer. I campioni risultanti sono sospensioni di nuclei singoli puri che possono essere utilizzati per generare dati sull’espressione genica del singolo nucleo e sull’accessibilità della cromatina dalla stessa preparazione dei nuclei.
Introduction
I gliomi diffusi di grado inferiore (LGG), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti, sono neoplasie infiltrative che spesso si presentano nell’emisfero cerebrale. Gli LCG mostrano eterogeneità sia inter- che intra-tumorale, che non è guidata solo dalla popolazione tumorale, ma anche dalle cellule non maligne coinvolte in modo complesso nello sviluppo e nella progressione del tumore1,2,3,4,5.
Nell’ultimo decennio, c’è stata una valanga di dati genomici raccolti nel campo dei gliomi. Questi dati provengono principalmente da studi di sequenziamento dei tumori di massa e hanno contribuito immensamente alla caratterizzazione molecolare e all’attuale classificazione dei tumori cerebrali5,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, anche se questi studi hanno rivelato l’ampio panorama molecolare associato ai gliomi, c’è ancora una deludente mancanza di progressi per quanto riguarda l’intervento terapeutico. Uno degli ostacoli alla resistenza al trattamento nei tumori cerebrali è l’eterogeneità intratumorale. Per affrontare questo problema, vari studi si sono concentrati sull’eterogeneità genomica, trascrittomica, proteomica ed epigenetica presente all’interno di un tumore a livello di singola cellula12,13,14,15,16,17.
Sebbene ci siano stati notevoli progressi tecnologici nel campo delle singole cellule negli ultimi due anni, uno dei principali fattori limitanti è la disponibilità di campioni freschi necessari per isolare le cellule ed eseguire questi esperimenti. Per superare questa limitazione, ci sono stati diversi tentativi riusciti di eseguire saggi, come snRNA-seq e snATAC-seq da tessuti congelati, utilizzando nuclei piuttosto che cellule18,19. La maggior parte di questi metodi si basa su strategie di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza (FACS) o di filtrazione. Sia gli approcci a singola cellula che a singolo nucleo hanno i loro punti di forza e svantaggi. Gli approcci a singola cellula mantengono i trascritti mitocondriali, che sebbene possano essere informativi, possono anche ridurre la copertura del trascrittoma a causa della loro elevata abbondanza. Gli approcci di isolamento dei singoli nuclei eliminano un’alta percentuale della frazione mitocondriale, consentendo così una copertura più approfondita dei trascritti nucleari20.
Esistono varie piattaforme disponibili in commercio che sono state utilizzate negli ultimi anni per saggiare i dati di genomica a singola cellula, tra cui RNA-seq e ATAC-seq. Una delle piattaforme più importanti è la piattaforma 10x Genomics Chromium per l’espressione genica a singola cellula e la profilazione ATAC a singola cellula. Poiché la piattaforma funziona con l’aiuto di camere microfluidiche, eventuali detriti o aggregati possono ostruire il sistema portando alla perdita di dati, reagenti e preziosi campioni clinici. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende in gran parte dall’accurato isolamento di singole cellule / nuclei.
Il protocollo che dimostreremo qui è una combinazione leggermente modificata dei protocolli DroNc-seq e Omni-ATAC-seq e utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq per comprendere disturbi neurologici e tipi di cellule neuronali nel cervello umano18,19,21,22,23,24. Il protocollo utilizza una combinazione di dissociazione enzimatica/meccanica di campioni congelati seguita da filtrazione e centrifugazione a gradiente e consente un isolamento rapido e accurato di singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione dei nuclei da campioni di tumore al cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il campo dell’eterogeneità intratumorale è in una fase entusiasmante, con nuovi saggi e piattaforme in fase di sviluppo per sfidare ed espandere le conoscenze esistenti. L’eterogeneità intratumorale è un fattore cruciale che contribuisce alla progressione della malattia e alla resistenza alle attuali modalità di trattamento nei gliomi28. Recenti studi sui tumori cerebrali si sono concentrati su questo importante aspetto utilizzando saggi trascrittomici ed epigenomici monocellulari per caratte…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Single Cell Open Lab (scOpenLab) presso il German Cancer Center (DKFZ) per le discussioni utili. Questa ricerca è stata supportata dal German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
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