単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化
Summary
ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。単一の AuNR の位置と向きは ImageJ および MATLAB を使用して検出され、AuNRs の拡散状態は単一の粒子追跡解析によって特徴付けられる。
Abstract
細胞膜上のナノ粒子の拡散ダイナミクスを分析することは、細胞取り込みプロセスをよりよく理解する上で重要な役割を果たし、ナノメディシンデリバリーの合理的設計の理論的根拠となる。単一粒子追跡(SPT)解析は、細胞膜上の個々のナノ粒子の位置と向きを調査し、その並進状態と回転状態を明らかにすることができる。ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、生細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。また、ImageJ と MATLAB を使用して AuNRs の位置と方向を抽出する方法と、AuNRs の拡散状態を特徴付ける方法についても説明します。数百個の粒子の統計解析は、単一のAuNRsがU87 MG細胞膜の表面でブラウン運動を行っていることを示しています。しかし、個々の長い軌道分析は、AuNRsが膜上の動き状態の2つの明確に異なるタイプ、すなわち長距離輸送および限られた領域の閉じ込めを有することを示す。当社のSPT法は、異なる生物学的細胞における表面または細胞内粒子拡散を研究するために使用される可能性があり、複雑な細胞機構の調査のための強力なツールとなり得ます。
Introduction
膜上のナノ粒子(NPs)のダイナミクスは、細胞の取り込みプロセスと密接に関連しており、細胞機能、ウイルスまたは細菌感染、および人工ナノ医療デリバリーシステム1,2の開発の理解に不可欠である。単一粒子追跡(SPT)技術は、NP3,4の異種挙動を特徴付けるための堅牢なツールです。一般に、細胞膜は流体であり、タンパク質や脂質などの成分が、形質膜面5、6、7内で横に移動できることを意味する。膜組織と構造の時空間的な複雑さは、NPと膜の相互作用の時空間的不均一性をもたらす可能性がある。したがって、膜上のNPの動きを直接可視化するには、高い空間解像度と時間的解像度の両方が必要です。
数十ナノメートルの空間分解能とミリ秒の時間分解能を有する生細胞における個々の粒子の局在を監視する単一粒子追跡顕微鏡は、NPまたは膜分子ダイナミクス8,9を研究するために十分に開発されている。蛍光ベースの顕微鏡イメージング技術は、生細胞環境9、10、11、12の中でNPs/分子を観察するための貴重なツールとなっています。例えば、全内部反射蛍光顕微鏡検査は、高い時空間分解能を有する基板/溶液界面で試料の薄層(〜100nm)を画像化する、膜分子ダイナミクス13,14の研究において広く用いられている。しかし、低強度や急速な不可逆的な光の漂白のような単一の蛍光ホルの固有の欠点は、トラッキング13の精度と持続時間を低下させる。したがって、蛍光プローブに代わる非蛍光プラズモニックNPは、そのユニークな光学特性15による長期イメージング研究においてますます注目を集めている。プラズモニックNPプローブの散乱信号に基づいて、暗視野顕微鏡(DFM)16、インターフェログメトリック散乱(iSCAT)顕微鏡法17、差動干渉差影顕微鏡(DICM)18などの生物学的プロセスのメカニズムを研究するために、数種類の光学顕微鏡イメージング技術が使用されている。さらに、DFM および DICM 18、19、 20、21、22を使用して、AuNRs のモーションと回転の動きが得られます。典型的には、SPT実験において、対象物の運動は光学顕微鏡によって記録され、次いでSPT分析方法3によって分析される。個々のNPによって生成される時間分解軌道と向きの角度は、通常、確率的で異種的であるため、さまざまな解析方法で豊富な動的情報を提示する必要があります。
ここでは、DFMを用いて細胞膜上のAuNRsのダイナミクスを監視し、ImageJおよびMATLABでAuNRsの位置と向きを抽出し、SPT分析法によるAuNRsの拡散を特徴付ける統合プロトコルを提供します。このデモンストレーションとして、U87 MG細胞膜上の非修飾AuNRs(CTAB-AuNRs、セチルトリメチルアンモニウムアンモニウム臭化アンモニウム分子によって合成された)のダイナミクスを可視化する方法を示す。CTAB-AuNRsは、生物学的環境でタンパク質を吸引し、細胞膜上を移動し、細胞2、20、22に入ることができることが実証されている。U87 MG細胞は中枢神経系の最も一般的で最も悪性の腫瘍であり、その膜受容体は異常に発現する。膜受容体は、AuNRsのタンパク質と相互作用し、AuNRsのダイナミクスに影響を与えます。我々のプロトコルは、一般に生物学の分野で他のSPT実験に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは細胞膜のAuNRsの動態を研究するために使用される。このプロトコルは、顕微鏡イメージング、データ抽出、動的パラメータ計算、データ分析方法など4つの部分で構成され、各部分は柔軟で普遍的です。したがって、膜上のNP結合膜分子の動き、NP標識受容体のエンドサイトーシスダイナミクス、微小管に沿った細胞内NPおよび小胞被覆NPの動的分析など、将来の応用が?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団の助成番号21425519、91853105、21621003によって支援されました。
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referenzen
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