Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy
Summary
Здесь мы показываем использование традиционной микроскопии темного поля для мониторинга динамики нанородов золота (AUNRs) на клеточной мембране. Местоположение и ориентация отдельных AUNRs обнаруживаются с помощью ImageJ и MATLAB, а диффузные состояния AUNRs характеризуются анализом отслеживания отдельных частиц.
Abstract
Анализ диффузной динамики наночастиц на клеточной мембране играет значительную роль в лучшем понимании процесса поглощения клеток и обеспечивает теоретическую основу для рационального проектирования доставки нано-медицины. Анализ слежения за отдельными частицами (SPT) может исследовать положение и ориентацию отдельных наночастиц на клеточной мембране и выявить их трансляционные и вращательное состояния. Здесь мы покажем, как использовать традиционную микроскопию темного поля для мониторинга динамики нанородов золота (AUNRs) на мембране живых клеток. Мы также показываем, как извлечь расположение и ориентацию AuNRs с помощью ImageJ и MATLAB, и как охарактеризовать диффузные состояния AUNRs. Статистический анализ сотен частиц показывает, что одиночные AUNRs выполняют броуианское движение на поверхности мембраны клеток U87 MG. Однако индивидуальный анализ длинной траектории показывает, что AUNRs имеют два совершенно разных типа состояний движения на мембране, а именно транспортировку на большой дальности и ограничение зоны заключения. Наши методы SPT потенциально могут быть использованы для изучения поверхности или внутриклеточной диффузии частиц в различных биологических клетках и могут стать мощным инструментом для исследования сложных клеточных механизмов.
Introduction
Динамика наночастиц (NPs) на мембране тесно связана с клеточным процессом поглощения, который необходим для понимания клеточных функций, вирусных или бактериальных инфекций и развития искусственных нанометических систем доставки1,2. Техника отслеживания отдельных частиц (SPT) является надежным инструментом для характеристики неоднородного поведения NPs3,4. В целом, клеточная мембрана является жидкой, что означает, что такие компоненты, как белки и липиды могут двигаться боково вплазменной мембране плоскости 5,6,7. Spatiotemporal сложность мембраны организации и структуры может привести к spatiotemporal неоднородность взаимодействия между NPs и мембраны. Следовательно, прямая визуализация движения NPs на мембране требует как высокого пространственного, так и временного разрешения.
Микроскопия слежения за отдельными частицами, которая отслеживает локализацию отдельных частиц в живых клетках с пространственным разрешением в десятки нанометров и разрешением времени миллисекунд, была хорошо разработана для изучения NPs или мембранных молекулдинамики 8,9. Флуоресценция основе микроскопических методов визуализации стали ценными инструментами для наблюдения NPs /молекулы в среде живых клеток 9,10,11,12. Например, общая внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения, которая изображения тонких слоев (100 нм) образца на подложке / раствор интерфейс с высоким spatiotemporal разрешение широко используется в исследованиях мембранных молекулдинамики 13,14. Тем не менее, присущие недостатки одиночных флюорофоров, таких как низкая интенсивность и быстрое необратимое фотоотлив снижают точность и продолжительность отслеживания13. Таким образом, нефлуоресцентные плазмонные NPs, которые заменяют флуоресцентные зонды, привлекают все больше и больше внимания в долгосрочных исследованиях изображений из-за их уникальныхоптических характеристик 15. На основе рассеяния сигналов плазмонные зонды NP, несколько видов оптических микроскопических технологий визуализации были использованы для изучения механизма биологических процессов, таких как темно-полевой микроскопии (DFM)16, интерферометрические рассеяния (iSCAT)микроскопии 17 и дифференциального вмешательства контрастной микроскопии (DICM)18. Кроме того, динамику движения и вращения AUNRs можно получить с помощью DFM и DICM18,19,20,21,22. Как правило, в эксперименте SPT движение объекта записывается оптическим микроскопом, а затем анализируется методами анализа SPT3. Решенные по времени траектории и ориентационные углы, генерируемые отдельными NPs, как правило, стохастичны и неоднородны, поэтому необходимо представить обильную динамическую информацию с помощью различных методов анализа.
Здесь мы предоставляем интегрированный протокол, который отслеживает динамику AUNRs на клеточной мембране с помощью DFM, извлекает расположение и ориентацию AuNRs с ImageJ и MATLAB и характеризует распространение AuNRs с методами анализа SPT. В качестве демонстрации мы показываем здесь, как использовать протокол SPT для визуализации динамики неизмененных AuNRs (CTAB-AuNRs, синтезированных cetyltrimethylammonium молекулы бромида аммония в качестве защитного агента) на мембране клеток U87 MG. Было продемонстрировано, что CTAB-AuNRs может адсорбировать белки в биологической среде, двигаться по клеточной мембране, а затемвойти в клетки 2,20,22. Клетка U87 MG является наиболее распространенной и злокачественной опухолью центральной нервной системы, а ее мембранные рецепторы аномально выражены. Мембранные рецепторы могут взаимодействовать с белками на AUNRs, которые влияют на динамику AUNRs. Наш протокол, как правило, применим к другим экспериментам SPT в области биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол используется для изучения динамики AUNRs на клеточной мембране. Протокол состоит из четырех частей, включая микроскопическую визуализацию, извлечение данных, расчет динамических параметров и методы анализа данных, и каждая часть является гибкой и универсальной….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая с номерами грантов 21425519, 91853105 и 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referenzen
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
