Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie
Summary
Hoewel replicatievorkbotsingen met DNA-adducten dubbele strengsbreuken kunnen veroorzaken, is er minder bekend over de interactie tussen replisomen en blokkerende laesies. We hebben de proximity ligation assay gebruikt om deze ontmoetingen te visualiseren en de gevolgen voor de replisoomsamenstelling te karakteriseren.
Abstract
Er is veel inzicht aanwezig in de cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken (DSB’s), geïnduceerd door nucleasen, straling en andere DNA-brekers. Voor een deel weerspiegelt dit de beschikbaarheid van methoden voor de identificatie van pauzeplaatsen en de karakterisering van factoren die bij die sequenties voor DSB’s zijn gerekruteerd. DSB’s verschijnen echter ook als tussenproducten tijdens de verwerking van DNA-adducten gevormd door verbindingen die niet direct breuken veroorzaken en niet reageren op specifieke sequentieplaatsen. Bijgevolg zijn voor de meeste van deze middelen technologieën die de analyse van bindingsinteracties met responsfactoren en reparatie-eiwitten mogelijk maken, onbekend. DNA interstrand crosslinks (ICL’s) kunnen bijvoorbeeld breuken veroorzaken na replicatievorkontmoetingen. Hoewel gevormd door geneesmiddelen die veel worden gebruikt als kankerchemotherapeutica, is er geen methodologie voor het monitoren van hun interacties met replicatie-eiwitten.
Hier beschrijven we onze strategie voor het volgen van de cellulaire reactie op vorkbotsingen met deze uitdagende adducten. We koppelden een steroïde antigeen aan psoraleen, dat fotoactivatieafhankelijke ICL’s vormt in kernen van levende cellen. De ICL’s werden gevisualiseerd door immunofluorescentie tegen de antigeentag. De tag kan ook een partner zijn in de Proximity Ligation Assay (PLA) die de nauwe associatie van twee antigenen rapporteert. De PLA werd gebruikt om eiwitten te onderscheiden die nauw verbonden waren met de gelabelde ICL’s en eiwitten die dat niet waren. Het was mogelijk om replisoomeiwitten te definiëren die werden behouden na ontmoetingen met ICL’s en andere te identificeren die verloren waren gegaan. Deze aanpak is van toepassing op elke structuur of DNA-adduct dat immunologisch kan worden gedetecteerd.
Introduction
De cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken is goed gedocumenteerd dankzij een opeenvolging van steeds krachtigere methoden om breuken naar specifieke genomische locaties te leiden 1,2,3. De zekerheid van locatie maakt een eenduidige karakterisering mogelijk van eiwitten en andere factoren die zich op de locatie ophopen en deelnemen aan de DNA Damage Response (DDR), waardoor de niet-homologe eindverbindingsroutes (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) worden aangedreven die breuken repareren. Natuurlijk worden veel pauzes geïntroduceerd door middelen zoals straling en chemische soorten die specifieke sequenties niet aanvallen4. Hiervoor zijn er echter procedures beschikbaar die de uiteinden kunnen omzetten in structuren die geschikt zijn voor tagging en lokalisatie 5,6. Onderbrekingen worden ook geïntroduceerd door biologische processen, zoals immunoglobuline-herschikking, en recente technologie maakt hun lokalisatie mogelijk, evenals7. De relatie tussen responsieve factoren en die sites kan dan worden bepaald.
Breuken verschijnen ook als een indirect gevolg van adducten gevormd door verbindingen die geen inherente brekers zijn, maar DNA-transacties zoals transcriptie en replicatie verstoren. Ze kunnen worden gevormd als een kenmerk van de cellulaire reactie op deze obstructies, misschien tijdens reparatie of omdat ze een structuur veroorzaken die kwetsbaar is voor nuclease-aanval. Meestal is de fysieke relatie tussen het adduct, de breuk en de associatie met reagerende factoren inferentieel. ICL’s worden bijvoorbeeld gevormd door chemotherapeutica zoals cisplatine en Mitomycine C8 en als reactieproduct van abasisch sites9. ICL’s staan bekend als krachtige blokken voor replicatievorken10, waardoor vorken worden geblokkeerd die kunnen worden gesplitst door nucleasen11. De covalente koppeling tussen strengen wordt vaak verlicht door paden met obligate breuken als tussenproducten 12,13, waardoor homologe recombinatie nodig is om de replicatievork14 opnieuw op te bouwen. In de meeste experimenten volgt de onderzoeker de reactie van factoren die van belang zijn op de breuken die worden gevormd stroomafwaarts van de botsing van een replicatievork met een ICL. Omdat er echter geen technologie is geweest voor de lokalisatie van een provocerende laesie, kan de nabijheid van het replisoom en zijn samenstellende delen tot de ICL alleen worden aangenomen.
We hebben een strategie ontwikkeld om de analyse van eiwitassociaties met niet-sequentiespecifieke covalente adducten mogelijk te maken, hier geïllustreerd door ICL’s. In ons systeem worden deze geïntroduceerd door psoraleen, een fotoactief natuurproduct dat al duizenden jaren wordt gebruikt als therapeutisch middel voor huidaandoeningen15. Onze aanpak is gebaseerd op twee belangrijke kenmerken van psoralenen. De eerste is hun hoge frequentie van crosslinkvorming, die 90% van de adducten kan overschrijden, in tegenstelling tot de minder dan 10% gevormd door populaire verbindingen zoals cisplatine of Mitomycine C 8,16. De tweede is de toegankelijkheid van de verbinding tot conjugatie zonder verlies van crosslinking-capaciteit. We hebben trimethyl psoraleen covalent gekoppeld aan Digoxigenin (Dig), een lang gevestigde immunotag. Dit maakt detectie van de psoraleenadducten in genomisch DNA mogelijk door immunostaining van de Dig-tag en visualisatie door conventionele immunofluorescentie17.
Dit reagens werd in ons vorige werk toegepast op de analyse van replicatievorkontmoetingen met ICL’s met behulp van een op DNA-vezels gebaseerde test16. In dat werk ontdekten we dat replicatie verder kon gaan dan een intacte ICL. Dit was afhankelijk van het ATR-kinase, dat wordt geactiveerd door replicatiestress. De herstart van de replicatie was onverwacht gezien de structuur van de CMG-replicatieve helicase. Dit bestaat uit de MCM hetero-hexamer (M) die een offset gapped ring vormt rond de sjabloonstreng voor leidende strengsynthese die wordt vergrendeld door de eiwitten van het GINS-complex (G, bestaande uit PSF1, 2, 3 en SLD5) en CDC45 (C)18. Het voorstel dat replicatie opnieuw kon starten aan de kant van de ICL-distale naar de kant van de replisoombotsing pleitte voor een verandering in de structuur van het replisoom. Om de vraag te beantwoorden welke componenten zich in het replisoom bevonden op het moment van de ontmoeting met een ICL hebben we de hier beschreven aanpak ontwikkeld. We gebruikten de Dig-tag als partner in Proximity Ligation Assays (PLA)19 om de nauwe associatie van de ICL met eiwitten van het replisoom20 te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de PLA een zeer krachtige techniek is, zijn er technische problemen die moeten worden opgelost om duidelijke en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De antilichamen moeten een hoge affiniteit en specificiteit hebben. Verder is het belangrijk om de niet-specifieke achtergrondsignalen zoveel mogelijk te beperken. We hebben ontdekt dat membranen en cellulair puin bijdragen aan de achtergrond en we hebben ze zoveel mogelijk verwijderd. De wasbeurten met wasmiddel met buffers voorafgaand aan het fixeren en de was …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH, National Institute on Aging, Verenigde Staten (Z01-AG000746-08). J.H. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundations of China (21708007 en 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
Referenzen
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
