Visualisation de rencontres répliquantes avec une lésion bloquante marquée avec un antigène
Summary
Alors que les collisions de fourche de réplication avec des adduits à ADN peuvent induire des cassures double brin, on en sait moins sur l’interaction entre les réplisomes et les lésions bloquantes. Nous avons utilisé le test de ligature de proximité pour visualiser ces rencontres et caractériser les conséquences pour la composition réplisomique.
Abstract
Des informations considérables sont présentes sur la réponse cellulaire aux cassures double brin (DSB), induites par les nucléases, les radiations et autres briseurs d’ADN. Cela s’explique en partie par la disponibilité de méthodes d’identification des sites de rupture et de caractérisation des facteurs recrutés dans les ORD à ces séquences. Cependant, les DSB apparaissent également comme intermédiaires lors du traitement des adduits à l’ADN formés par des composés qui ne provoquent pas directement de cassures et ne réagissent pas à des sites de séquence spécifiques. Par conséquent, pour la plupart de ces agents, les technologies qui permettent d’analyser les interactions de liaison avec les facteurs de réponse et les protéines de réparation sont inconnues. Par exemple, les liaisons croisées interbrins d’ADN (ICL) peuvent provoquer des ruptures à la suite de rencontres de fourche de réplication. Bien que formés par des médicaments largement utilisés comme agents chimiothérapeutiques contre le cancer, il n’existe aucune méthodologie pour surveiller leurs interactions avec les protéines de réplication.
Ici, nous décrivons notre stratégie pour suivre la réponse cellulaire aux collisions de fourche avec ces adduits difficiles. Nous avons lié un antigène stéroïdien au psoralène, qui forme des LCI dépendantes de la photoactivation dans les noyaux des cellules vivantes. Les ICL ont été visualisés par immunofluorescence contre l’étiquette de l’antigène. Le marqueur peut également être un partenaire dans le test de ligature de proximité (PLA) qui rapporte l’association étroite de deux antigènes. Le PLA a été exploité pour distinguer les protéines qui étaient étroitement associées aux ICL marquées de celles qui ne l’étaient pas. Il a été possible de définir les protéines réplisomes qui ont été retenues après des rencontres avec les ICL et d’identifier d’autres qui ont été perdues. Cette approche est applicable à toute structure ou adduit à ADN qui peut être détecté immunologiquement.
Introduction
La réponse cellulaire aux cassures double brin est bien documentée grâce à une succession de méthodes de plus en plus puissantes pour diriger les cassures vers des sites génomiques spécifiques 1,2,3. La certitude de l’emplacement permet une caractérisation sans ambiguïté des protéines et d’autres facteurs qui s’accumulent sur le site et participent à la réponse aux dommages de l’ADN (DDR), conduisant ainsi les voies de jonction terminale non homologue (NHEJ) et de recombinaison homologue (HR) qui réparent les cassures. Bien sûr, de nombreuses cassures sont introduites par des agents tels que les radiations et les espèces chimiques qui n’attaquent pas des séquences spécifiques4. Cependant, pour ceux-ci, il existe des procédures disponibles qui peuvent convertir les extrémités en structures se prêtant au marquage et à la localisation 5,6. Les cassures sont également introduites par des processus biologiques, tels que le réarrangement des immunoglobulines, et la technologie récente permet leur localisation, ainsi que7. La relation entre les facteurs de réponse et ces sites peut alors être déterminée.
Les cassures apparaissent également comme une conséquence indirecte des adduits formés par des composés qui ne sont pas des briseurs inhérents mais perturbent les transactions de l’ADN telles que la transcription et la réplication. Ils peuvent être formés comme une caractéristique de la réponse cellulaire à ces obstructions, peut-être pendant la réparation ou parce qu’ils provoquent une structure vulnérable à l’attaque de la nucléase. En règle générale, la relation physique entre l’adduit, la rupture et l’association avec les facteurs de réponse est inférentielle. Par exemple, les ICL sont formés par des agents chimiothérapeutiques tels que le cisplatine et la mitomycineC8 et comme produit de réaction des sites abasiques9. Les ICL sont bien connus comme des blocs puissants pour les fourches de réplication10, bloquant ainsi les fourches qui peuvent être clivées par les nucléases11. La liaison covalente entre les brins est souvent soulagée par des voies qui ont des ruptures obligatoires comme intermédiaires12,13, nécessitant une recombinaison homologue pour reconstruire la fourche de réplication 14. Dans la plupart des expériences, l’investigateur suit la réponse des facteurs d’intérêt aux ruptures qui se forment en aval de la collision d’une fourche de réplication avec une ICL. Cependant, comme il n’y a pas eu de technologie pour localiser une lésion provocatrice, la proximité du réplisome et de ses composants avec la LMIC ne peut que supposer.
Nous avons développé une stratégie pour permettre l’analyse des associations protéiques avec des adduits covalents non spécifiques à la séquence, illustrée ici par les ICL. Dans notre système, ceux-ci sont introduits par le psoralène, un produit naturel photoactif utilisé depuis des milliers d’années comme thérapeutique pour les troubles cutanés15. Notre approche est basée sur deux caractéristiques importantes des psoralènes. Le premier est leur fréquence élevée de formation de réticulation, qui peut dépasser 90% des adduits, contrairement aux moins de 10% formés par des composés populaires tels que le cisplatine ou la mitomycine C 8,16. La seconde est l’accessibilité du composé à la conjugaison sans perte de capacité de réticulation. Nous avons lié de manière covalente le triméthyl psoralène à la digoxigénine (Dig), un immunomarqueur établi de longue date. Cela permet la détection des adduits psoralènes dans l’ADN génomique par immunomarquage du marqueur Dig, et la visualisation par immunofluorescence conventionnelle17.
Ce réactif a été appliqué, dans nos travaux précédents, à l’analyse des rencontres de fourche de réplication avec des ICL à l’aide d’un test à base de fibres d’ADN16. Dans ce travail, nous avons constaté que la réplication pouvait se poursuivre au-delà d’une LMIC intacte. Cela dépendait de la kinase ATR, qui est activée par la contrainte de réplication. Le redémarrage de la réplication était inattendu compte tenu de la structure de l’hélicase réplicative CMG. Il s’agit de l’hétéro-hexamère MCM (M) qui forme un anneau décalé autour du brin modèle pour la synthèse du brin principal qui est verrouillé par les protéines du complexe GINS (G, constitué de PSF1, 2, 3 et SLD5) et CDC45 (C) 18. La proposition selon laquelle la réplication pourrait redémarrer du côté de la distale ICL du côté de la collision du replisome plaide en faveur d’un changement de la structure du réplisome. Pour répondre à la question de savoir quels composants étaient dans le réplisome au moment de la rencontre avec une ICL, nous avons développé l’approche décrite ici. Nous avons exploité l’étiquette Dig en tant que partenaire dans les tests de ligature de proximité (PLA)19 pour interroger l’association étroite de la LCI avec les protéines du réplisome20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le PLA soit une technique très puissante, il existe des problèmes techniques qui doivent être résolus afin d’obtenir des résultats clairs et reproductibles. Les anticorps doivent être de haute affinité et spécificité. En outre, il est important de réduire autant que possible les signaux de fond non spécifiques. Nous avons constaté que les membranes et les débris cellulaires contribuent à l’arrière-plan, et nous les avons enlevés autant que possible. Les lavages avec des tampons contenant du d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée, en partie, par le programme de recherche intra-muros du NIH, National Institute on Aging, États-Unis (Z01-AG000746–08). J.H. est soutenu par les Fondations nationales des sciences naturelles de Chine (21708007 et 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
Referenzen
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
