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Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

DOI:

10.3791/61964

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November 3rd, 2020

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1Department of Medicine I, University Hospital Munich, Campus Großhadern, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 2Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 4Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Göttingen, 5Partner Site Göttingen, DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 6Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Göttingen

In This Article

Summary

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Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Abstract

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Mausmodelle spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung und ermöglichen die Untersuchung von Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese, einschließlich der veränderten Ionenkanalfunktion und des Kalziumhandlings. Zu diesem Zweck sind atriale oder ventrikuläre Kardiomyozyten von hoher Qualität notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen oder Calcium-Handling-Anomalien zu untersuchen. Die begrenzte Ausbeute an qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten, die mit den derzeitigen Isolationsprotokollen gewonnen wird, erlaubt jedoch nicht beide Messungen in derselben Maus. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion für die anschließende simultane Messung von Calciumtransienten und L-Typ-Calciumstrom von einem Tier. Mäuseherzen werden gewonnen, und die Aorta wird schnell kanüliert, um Blut zu entfernen. Die Herzen werden dann zunächst mit einer kalziumfreien Lösung (37 °C) perfundiert, um das Gewebe auf der Ebene der interkalierten Bandscheiben zu dissoziieren, und anschließend mit einer Enzymlösung, die wenig Kalzium enthält, um die extrazelluläre Matrix (37 °C) zu stören. Das verdaute Herz wird anschließend in Vorhöfe und Ventrikel zerlegt. Gewebeproben werden in kleine Stücke zerkleinert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aufgelöst. Die enzymatische Verdauung wird gestoppt und die Zellen werden schrittweise wieder in physiologische Kalziumkonzentrationen gebracht. Nach Beladung mit einem fluoreszierenden Ca2+-Indikator werden isolierte Kardiomyozyten für die simultane Messung von Calciumströmen und -transienten präpariert. Darüber hinaus werden Isolationsfallstricke diskutiert und Patch-Clamp-Protokolle und repräsentative Spuren von L-Typ-Calciumströmen mit simultanen Calciumtransientenmessungen in atrialen und ventrikulären murinen Myozyten, die wie oben beschrieben isoliert wurden, bereitgestellt.

Introduction

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Herzrhythmusstörungen sind weit verbreitet und eine der größten Herausforderungen im Gesundheitswesen, da sie Millionen von Menschen weltweit betreffen. Herzrhythmusstörungen sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert 1,2 und stellen die zugrunde liegende Ursache für die Mehrzahl der plötzlichen Herztodedar 3. Heutige Behandlungsoptionen haben das Überleben der Patienten verbessert, sind aber immer noch hauptsächlich symptomatische Behandlungen, anstatt auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzuzielen. Daher sind diese Behandlungen nur begrenzt wirksam und können häufig ....

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Protocol

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Alle Tierverfahren wurden vom Niedersächsischen Tierprüfungsamt (LAVES, AZ-18/2900) genehmigt und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für den Tierschutz durchgeführt.

1. Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie 1 l 10x Perfusionspuffer (Tabelle 1), 500 ml 1x Perfusionspuffer (Tabelle 2), 50 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 3), 10 ml Stopppuffer (Tabelle 4), 1 l Tyrode-Lösung (Tabelle 5), 10 ml jeder Calcium-Stufenlösung (Tyrode-Lösung mit Glukose und entsprechender Menge an Calcium wie angegeben) vor. 1 l 4-AP....

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Results

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Die Isolationsausbeute wird nach der Wiedereinführung von Calcium bestimmt, indem 10 μl Zellsuspension auf einen Objektträger pipettiert werden. Mehr als 100 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung von Vorhofzellen und mehr als 1.000 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung ventrikulärer Zellen gelten als ausreichende Ausbeute und werden üblicherweise mit diesem Protokoll gewonnen. Vorhofzellen, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden.......

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Discussion

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Dieser Artikel bietet eine einfache und funktionelle Möglichkeit, qualitativ hochwertige atriale und ventrikuläre Myozyten von derselben Maus für Patch-Clamp-Studien mit gleichzeitigen transienten Kalziumableitungen zu erhalten. Die Qualität der gewonnenen Daten hängt stark von der Qualität der Zellisolierung ab. Wie oben erwähnt, wurden bereits viele Verfahren zur Isolierung von murinen Kardiomyozyten beschrieben 9,10,11,12.

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Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 an P. Tomsits und D. Schüttler; VO1568/3-1, IGK 1816 und SFB1002 Projekt A13 bis N. Voigt), Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder (EXC 2067/1- 390729940 an N. Voigt), Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss und N. Voigt; 81Z0600206 an S. Kääb), die Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), das ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss), die Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl-Stiftung (an S. Clauss) und die El....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,3-Butandion-MonoximSigma-Aldrich31550
27G KanüleServopraxL10220
4-AminopyridinSigma-AldrichA78403
Wasserfreies DMSOSigma-AldrichD12345
AortenkanüleRadnoti130163-20
BaCl2Sigma-Aldrich342920
stumpfe chirurgische ZangeKent ScientificINS650915-4
Serum für RinderkälberSigma-Aldrich12133C
CaCl2Sigma-AldrichC5080
Zirkulierendes beheiztes WasserbadJulaboME
Kollagenase Typ IIWorthington LS994177
SchereKent ScientificINS600124
DL-aspartat K+-saltSigma-AldrichA2025
EGTASigma-AldrichE4378
Fluo-3InvitrogenF3715
Fluo-3 AMInvitrogenF1242
GlucoseSigma-AldrichG8270
Guanosin 5′-triphosphat tris salzSigma-AldrichG9002
HeizspiraleRadnoti158821
HeparinRatiopharm25.000 IE/5ml
HEPESSigma-AldrichH9136
InduktionskammerCWE eingebaut13-40020
IsofluranCp-pharma1214
Ummantelte HerzkammerRadnoti130160
KClMerck1049360250
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
MgCl x 6H2OSigma-AldrichM0250
MgSO4 x 7H2OSigma-AldrichM9397
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Na2HPO4 x 2H2OSigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichS3014
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
Nylon Mesh (200 & Mikro; m)VWR-Germany510-9527
PasteurpipetteSigma AldrichZ331759
PetrischalenThermo Fisher150318
Pluronsäure F-127Sigma-AldrichP2443
ProbenecidSigma-AldrichP8761
RollenpumpeIsmatecISM597D
chirurgisch PinzetteKent ScientificINS650908-4
chirurgische SchereKent ScientificINS700540
Naht SeideFine Science ToolsNC9416241
SpritzeMerckZ683531-100EA
TaurinSigma-Aldrich86330

References

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  1. Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
  2. Chugh, S. S., et al.

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Murine CardiomyocytesAtrial MyocytesVentricular MyocytesLangendorff PerfusionEnzyme Based IsolationCalcium Free SolutionTissue DigestionCell SuspensionPatch ClampCalcium Imaging

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