Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа
Summary
Мышиные модели позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза. Для этого необходимы высококачественные кардиомиоциты для проведения измерений патч-зажимом. Здесь описан метод выделения предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа, который позволяет одновременно измерять кальциевые переходные процессы и кальциевый ток L-типа.
Abstract
Мышиные модели играют решающую роль в исследованиях аритмии и позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза, включая изменение функции ионных каналов и обращение с кальцием. Для этого необходимы высококачественные кардиомиоциты предсердий или желудочков для проведения измерений с помощью пластыря или для изучения аномалий обработки кальция. Однако ограниченный выход высококачественных кардиомиоцитов, полученных с помощью современных протоколов выделения, не позволяет проводить оба измерения на одной и той же мыши. В данной статье описывается метод выделения высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа для последующих одновременных измерений кальциевых переходных процессов и кальциевого тока L-типа у одного животного. Получаются мышиные сердца, а аорта быстро канюлируется для удаления крови. Затем сердца сначала перфузируют раствором, не содержащим кальция (37 ° C), чтобы диссоциировать ткань на уровне интеркалированных дисков, а затем раствором фермента, содержащим мало кальция, для разрушения внеклеточного матрикса (37 ° C). Переваренное сердце впоследствии рассекается на предсердия и желудочки. Образцы тканей измельчают на мелкие кусочки и растворяют путем осторожного пипетирования вверх и вниз. Ферментативное переваривание прекращается, и клетки постепенно возвращаются к физиологическим концентрациям кальция. После загрузки флуоресцентным Са2+-индикатором выделяют выделенные кардиомиоциты для одновременного измерения кальциевых токов и переходных процессов. Кроме того, обсуждаются подводные камни изоляции и предоставляются протоколы патч-зажима и репрезентативные следы кальциевых токов L-типа с одновременными переходными измерениями кальция в предсердных и желудочковых мышиных миоцитах, изолированных, как описано выше.
Introduction
Сердечные аритмии являются распространенным явлением и одной из основных проблем здравоохранения в настоящее время, поскольку они затрагивают миллионы людей во всем мире. Аритмии связаны с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2 и представляют собой основную причину большинства внезапных сердечных смертей3. Современные варианты лечения улучшили выживаемость пациентов, но по-прежнему в основном являются симптоматическими методами лечения, а не нацелены на основные механизмы. Таким образом, эти методы лечения имеют ограниченную эффективность и часто могут вызывать серьезные побочные эффекты 4,5,6. Улучшение существующих вариантов лечения требует понимания лежащей в основе патофизиологии, что создает потребность в подходящих моделях для изучения. Модели мелких животных – и особенно модели мышей – играют решающую роль в исследованиях аритмии, поскольку они позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза, например, генетическое влияние на клеточную электрофизиологию, функцию ионных каналов или обработку кальция 7,8.
Для этого требуются изолированные предсердные и желудочковые кардиомиоциты достаточного количества и жизнеспособности. Ранее был описан широкий спектр различных подходов к выделению для получения предсердных и желудочковых миоцитов 9,10,11,12,13, а некоторые группы представили данные одновременных измерений кальциевых переходных процессов L-типа и кальциевых токов либо из предсердий 14, либо из желудочков 15 мышиные кардиомиоциты. Однако, насколько нам известно, нет данных об измерениях предсердий и желудочков у одного животного. Исследователи сосредотачиваются на широком спектре тем, начиная от электрофизиологии и заканчивая протеомикой, функциональными исследованиями, такими как сократимость клеток или белковые взаимодействия, функция митохондрий или генетика – все это нуждается в изолированных кардиомиоцитах. Таким образом, многие из опубликованных протоколов не были специально разработаны для исследований пластырного зажима, что приводит к ограниченному выходу и недостаточному качеству клеток для исследований пластырного зажима. Таким образом, одновременные пластырные зажимы и кальциевые переходные измерения клеток предсердий и желудочков, выделенных от одного животного, не могут быть выполнены с установленными протоколами.
Выделение мышиных, особенно предсердных, миоцитов для экспериментов с пластырем остается сложной задачей. В этой статье представлен простой и быстрый метод выделения высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа, который впоследствии позволяет одновременно измерять как чистый мембранный ток, так и ток-индуцированные кальциевые переходные процессы у одного животного. В данной статье разработан протокол выделения предсердных и желудочковых миоцитов, полученных от мышей дикого типа и мышей, несущих генетические мутации. Этот протокол можно использовать как для самцов, так и для самок мышей. Выделение миоцитов, изображения и репрезентативные результаты, описанные ниже, были получены от мышей дикого типа C57Bl/6 в возрасте 6 (± 1) месяцев. Тем не менее, этот протокол успешно используется для мышей в разном возрасте от 2 до 24 месяцев с разными генотипами. На рисунке 1 показана установка изоляции и крупный план канюлированного сердца во время ферментной перфузии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен простой и функциональный способ получения высококачественных миоцитов предсердий и желудочков от одной и той же мыши для исследований с помощью пластыря с одновременными записями переходных процессов кальция. Качество полученных данных сильно зависит от ка…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученых-клиницистов в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 для. Томсица и Д. Шюттлера; VO1568/3-1, IRTG1816 и SFB1002 проект A13 для Н. Фойгта), Немецкое научно-исследовательское общество в рамках Стратегии передового опыта Германии (EXC 2067/1-390729940 для Н. Фойгта), Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для С. Клаусса и Н. Фойгта; 81Z0600206 для С. Кяэба), Фонд Corona (S199/10079/2019 для С. Клаусса), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для С. Клаусса), Фонд Генриха и Лотте-Мюльфенцль (С. Клаусс) и Фонд Эльзе-Крёнер-Фрезениус (EKFS 2016_A20 Н. Фойгту). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Referenzen
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
