Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell
Summary
Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.
Abstract
Die Darmschleimhaut wird von einer einzigen Schicht von Epithelzellen ausgekleidet, die eine dynamische Barriere bildet, die den parazellulären Transport von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig die Passage von leuchtenden Bakterien und exogenen Substanzen verhindert. Ein Bruch dieser Schicht führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit für luminalen Inhalt und zur Rekrutierung von Immunzellen, die beide Kennzeichen pathologischer Zustände im Darm einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) sind.
Mechanismen, die die epitheliale Barrierefunktion und die transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN) regulieren, sind aufgrund des Mangels an experimentellen In-vivo-Methoden, die quantitative Analysen ermöglichen, unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes murines experimentelles Modell, das ein exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet. Die exteriorisierte Darmschleife (iLoop) ist vollständig vaskularisiert und bietet physiologische Vorteile gegenüber ex vivo kammerbasierten Ansätzen, die üblicherweise zur Untersuchung der Permeabilität und PMN-Migration über Epithelzellmonoschichten verwendet werden.
Wir zeigen zwei Anwendungen dieses Modells im Detail: (1) quantitative Messung der Darmpermeabilität durch Nachweis von fluoreszenzmarkiertem Dextrans im Serum nach intraluminaler Injektion, (2) quantitative Beurteilung von migriertem PMN über das Darmepithel in das Darmlumen nach intraluminaler Einführung von Chemoattraktantien. Wir demonstrieren die Machbarkeit dieses Modells und liefern Ergebnisse mit dem iLoop bei Mäusen, denen das epitheliale Tight Junction-assoziierte Protein JAM-A im Vergleich zu Kontrollen fehlt. Es wurde gezeigt, dass JAM-A die epitheliale Barrierefunktion sowie PMN TEpM bei Entzündungsreaktionen reguliert. Unsere Ergebnisse mit dem iLoop bestätigen frühere Studien und unterstreichen die Bedeutung von JAM-A bei der Regulation der Darmpermeabilität und PMN TEpM in vivo während der Homöostase und Erkrankung.
Das iLoop-Modell bietet eine hochstandardisierte Methode für reproduzierbare In-vivo-Studien der intestinalen Homöostase und Entzündung und wird das Verständnis der Darmbarrierefunktion und der Schleimhautentzündung bei Krankheiten wie IBD deutlich verbessern.
Introduction
Die Darmschleimhaut umfasst eine einzige Schicht aus säulenförmigen Darmepithelzellen (IECs), darunter liegenden Lamina propria Immunzellen und den Muscularis mucosae. Neben seiner Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen ist das Darmepithel eine physikalische Barriere, die das Körperinnere vor luminalen kommensalen Bakterien, Krankheitserregern und diätetischen Antigenen schützt. Darüber hinaus koordinieren IECs und Lamina propria-Immunzellen die Immunantwort, die je nach Kontext und Reizen entweder Toleranz oder Reaktion induziert. Es wurde berichtet, dass die Störung der Epithelbarriere dem Beginn einer pathologischen Schleimhautentzündung vorausgehen und zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beitragenkann,die sowohl Colitis ulcerosa als auch Morbus Crohnumfassen 1,2,3 ,4,5,6,7. Personen mit Colitis ulcerosa zeigen eine übermäßige transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN), die Kryptenabszesse bilden, ein Befund, der mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebracht wurde8,9. Obwohl eine beeinträchtigte epitheliale Barrierefunktion und übermäßige Immunantworten Kennzeichen von IBD sind, fehlt es an experimentellen In-vivo-Assays, um quantitative Bewertungen der Darmpermeabilität und der Rekrutierung von Immunzellen in die Darmschleimhaut durchzuführen.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung der intestinalen epithelialen Permeabilität und PMN TEpM verwenden ex vivo kammerbasierte Ansätze unter Verwendung von IEC-Monoschichten, die auf semipermeablen porösen Membraneinsätzen10,11,12kultiviert werden. Die Integrität der epithelialen Barriere wird entweder durch Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) oder des parazellulären Flusses des Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Dextrans vom apikalen zum basalen Kompartiment13,14,15überwacht. In ähnlicher Weise wird PMN TEpM typischerweise als Reaktion auf ein Chemoattraktum untersucht, das in der unteren Kammer16hinzugefügt wird. PMN werden in die obere Kammer gelegt und nach einer Inkubationszeit werden PMN, die in das Basalkompartiment gewandert sind, gesammelt und quantifiziert. Während diese Methoden nützlich, einfach durchzuführen und sehr reproduzierbar sind, sind sie offensichtlich reduktionistische Ansätze und stellen nicht unbedingt eine genaue Reflexion der In-vivo-Bedingungen dar.
Bei Mäusen ist ein gängiger Assay zur Untersuchung der intestinalen parazellulären Permeabilität durch orale Gavage von FITC-Dextran und anschließende Messung des FITC-Dextran-Aussehens im Blutserum13,17. Der Nachteil dieses Assays besteht darin, dass er eine Beurteilung der allgemeinen Barriereintegrität des Magen-Darm-Trakts und nicht die der regionalen Darmbeiträge darstellt. Darüber hinaus wird Evans-Blau häufig verwendet, um vaskuläre Leckagen in vivo18 zu bewerten, und wurde auch verwendet, um die Darmschleimhautpermeabilität bei Maus und Ratte19,20,21zu bewerten . Die Quantifizierung von Evansblau in der Darmschleimhaut erfordert die Extraktion aus Gewebe, das über Nacht in Formamid inkubiert wird. Daher kann das gleiche Gewebe nicht verwendet werden, um die intestinale epitheliale Permeabilität und die Neutrophileninfiltration zu untersuchen.
Hier heben wir ein einfaches Protokoll hervor, das die Anzahl der Tiere reduziert, die benötigt werden, um reproduzierbare Daten über die Durchlässigkeit der Kolonschleimhaut und die transepitheliale Migration von Leukozyten in vivo zu sammeln. Wir empfehlen daher die Verwendung von FITC-Dextrans, die im Blutserum leicht nachweisbar sind, ohne die Integrität der Darmschlingen zu beeinträchtigen, die für weitere Analysen geerntet werden können. Bemerkenswert ist, dass die intestinalen ligaierten Schleifen bei verschiedenen Arten (einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Kalb) verwendet wurden, um bakterielle Infektionen (wie Salmonellen, Listeria monocytogenes und Escherichia coli)22,23,24,25 sowie Darmpermeabilität26zu untersuchen; Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Studien, die Mechanismen von PMN TEpM in bestimmten Regionen des Darms wie Ileum oder Dickdarm untersuchen, die häufig an IBD beteiligt sind.
Hier beschreiben wir das Maus-Darmschleifenmodell (iLoop), das eine robuste und zuverlässige mikrochirurgische In-vivo-Methode ist, die ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment des Ileums oder des proximalen Dickdarms verwendet. Das iLoop-Modell ist physiologisch relevant und ermöglicht die Beurteilung der Darmbarriereintegrität und PMN TEpM an lebenden Mäusen unter Betäubung. Wir zeigen zwei Anwendungen: 1) Quantifizierung der Serumspiegel von 4 kDa FITC-Dextran nach intraluminaler Verabreichung im iLoop 2) Quantifizierung von transmigriertem PMN im iLoop-Lumen nach intraluminaler Injektion des starken Chemottraktans LeukotrienB4 (LTB4)27. Darüber hinaus wird das iLoop-Modell mit Jam-a-null-Mäusenoder Mäusen verwendet, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) im Vergleich zu Kontrollmäusen können wir frühere Studien bestätigen, die einen wichtigen Beitrag für Tight Junction-assoziiertes Protein JAM-A zur Darmpermeabilität und neutrophilen Transmigration berichtet haben15,28,29,30,31.
Das iLoop-Modell ist eine hochfunktionelle und physiologische Methode, mit der In-vitro-Assays bestätigt werden können. Darüber hinaus ist dies ein vielseitiges experimentelles Modell, das die Untersuchung verschiedener Reagenzien ermöglicht, die in das Schleifenlumen injiziert werden können, einschließlich Chemokine, Zytokine, bakterielle Krankheitserreger, Toxine, Antikörper und Therapeutika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Mechanismen, die für die Dysregulation der Darmbarrierefunktion und die Rekrutierung von Immunzellen unter pathologischen Erkrankungen wie IBD verantwortlich sind, sind unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes in vivo murines Modell, das ein gut vaskularisiertes exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet und die Beurteilung der Darmpermeabilität, neutrophilen Migrationsstudien sowie anderer Anwendungen ermöglicht.
Der iLoop ist…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Sven Flemming von der Universität Würzburg für seine Beiträge zur Etablierung des proximalen Dickdarmschleifenmodells, Sean Watson für das Management der Mauskolonien und Chithra K. Muraleedharan für die Hilfe bei der Anschaffung der Bilder des iLoop-Modells. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft/DFG (BO 5776/2-1) zu KB, R01DK079392, R01DK072564 und R01DK061379 zu C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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