Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado
Summary
La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.
Abstract
La mucosa intestinal está revesteada por una sola capa de células epiteliales que forma una barrera dinámica que permite el transporte paracelular de nutrientes y agua al tiempo que impide el paso de bacterias luminales y sustancias exógenas. Una brecha de esta capa da lugar a permeabilidad creciente al contenido luminal y al reclutamiento de células inmunes, que son sellos de estados patológicos en la tripa incluyendo la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD).
Los mecanismos que regulan la función epitelial de la barrera y la migración transepitelial (TEpM) de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) se entienden incompleto debido a la carencia de métodos in vivo experimentales que permiten análisis cuantitativos. Aquí, describimos un modelo experimental murino robusto que emplea un segmento intestinal exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El asa intestinal exteriorizado (iLoop) está completamente vascularizado y ofrece ventajas fisiológicas sobre los enfoques basados en cámaras ex vivo comúnmente utilizados para estudiar la permeabilidad y la migración de PMN a través de monocapas de células epiteliales.
Demostramos dos usos de este modelo detalladamente: (1) medida cuantitativa de la permeabilidad intestinal con la detección de dextrans fluorescencia-etiquetado en suero después de la inyección intramural, (2) evaluación cuantitativa de PMN emigrado a través del epitelio intestinal en el lumen de la tripa después de la introducción intramural de quimioatrayentes. Se demuestra la viabilidad de este modelo y proporcionar resultados utilizando el iLoop en ratones que carecen de la proteína epitelial asociada a la unión apretada JAM-A en comparación con los controles. JAM-A se ha mostrado para regular la función epitelial de la barrera así como PMN TEpM durante respuestas inflamatorias. Nuestros resultados utilizando el iLoop confirman estudios previos y destacan la importancia de JAM-A en la regulación de la permeabilidad intestinal y pmn TEpM in vivo durante la homeostasis y la enfermedad.
El modelo iLoop proporciona un método altamente estandarizado para estudios reproducibles in vivo de la homeostasis intestinal y la inflamación y mejorará significativamente la comprensión de la función de barrera intestinal y la inflamación de la mucosa en enfermedades como la EII.
Introduction
La mucosa intestinal abarca una sola capa de células epiteliales intestinales columnares (IECs), las células inmunes subyacentes del propria de la lámina y las mucosas de los muscularis. Además de su papel en la absorción de nutrientes, el epitelio intestinal es una barrera física que protege el interior del cuerpo de las bacterias comensales luminales, patógenos y antígenos dietéticos. Además, los IECs y las células inmunes de la lámina propia coordinan la inmunorespuesta que induce tolerancia o respuesta dependiendo del contexto y de los estímulos. Se ha divulgado que la interrupción de la barrera epitelial puede preceder el inicio de la inflamación de la mucosa patológica y contribuir a la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) que abarca colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Los individuos con colitis ulcerosa presentan migración transepitelial excesiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscesos de cripta, hallazgo que se ha asociado con la gravedad de la enfermedad8,9. Aunque la función epitelial comprometida de la barrera y las inmunorespuestas excesivas sean sellos de IBD, hay una carencia de análisis in vivo experimentales para realizar evaluaciones cuantitativas de la permeabilidad intestinal y del reclutamiento de la célula inmune en la mucosa intestinal.
Los métodos más comunes utilizados para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y PMN TEpM emplean enfoques basados en cámaras ex vivo utilizando monocapas IEC cultivadas en insertos de membrana porosa semipermeables10,11,12. La integridad de la barrera epitelial es supervisada por mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) o el flujo paracelular del isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano marcado desde el compartimento apical al basal13,14,15. Del mismo modo, pmn TEpM se estudia típicamente en respuesta a un quimioatrayente que se añade en la cámara baja16. Los PMN se colocan en la cámara superior y después de un período de incubación, los PMN que han migrado al compartimento basal se recogen y cuantifican. Si bien estos métodos son útiles, fáciles de realizar y muy reproducibles, son obviamente enfoques reduccionistas y no necesariamente representan un reflejo preciso de las condiciones in vivo.
En ratones, un ensayo común para estudiar la permeabilidad paracelular intestinal es por sonda oral de FITC-dextrano y posterior medición de la aparición de FITC-dextrano en el suero sanguíneo13,17. La desventaja de este análisis es que representa una evaluación de la integridad total de la barrera del aparato gastrointestinal bastante que la de contribuciones intestinales regionales. Además, el azul de Evans se utiliza comúnmente para evaluar la fuga vascular in vivo18 y también se ha empleado para evaluar la permeabilidad de la mucosa intestinal en ratones y ratas19,20,21. La cuantificación del azul de Evans en la mucosa intestinal requiere la extracción del tejido que emplea la incubación en formamida durante la noche. Por lo tanto, el mismo tejido no se puede utilizar para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y la infiltración de neutrófilos.
Aquí destacamos un protocolo simple que reduce el número de animales necesarios para recoger datos reproducibles sobre la permeabilidad de la mucosa colónica y la migración transepitelial leucocito in vivo. Por lo tanto, recomendamos el uso de FITC-dextrans que son fácilmente perceptibles en suero sanguíneo sin comprometer la integridad de los lazos intestinales que se pueden cosechar para el análisis adicional. Cabe destacar que los bucles ligados intestinales se han utilizado en varias especies (incluyendo ratón, rata, conejo, ternero) para estudiar la infección bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes y Escherichia coli)22,23,24,25, así como la permeabilidad intestinal26; sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento no hay estudios que investigan mecanismos de PMN TEpM en regiones específicas en el intestino tal como íleo o dos puntos que están implicados comúnmente en IBD.
Aquí describimos el modelo del lazo intestinal del ratón (iLoop) que es un método in vivo microquirúrgico robusto y confiable que emplea un segmento intestinal bien-vascularizado y exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El modelo iLoop es fisiológicamente relevante y permite la evaluación de la integridad de la barrera intestinal y pmn TEpM en ratones vivos bajo anestesia. Demostramos dos aplicaciones: 1) cuantificación de los niveles séricos de 4 kDa FITC-dextrano después de la administración intraluminal en el iLoop 2) cuantificación de PMN transmigrado en el lumen iLoop después de la inyección intraluminal del potente quimiotractor Leucotrieno B4 (LTB4)27. Por otra parte, la utilización del modelo iLoop con Jam-a-null ratones o ratones que albergan la pérdida selectiva de JAM-A en IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl)en comparación con los ratones control, podemos corroborar estudios previos que han reportado una importante contribución de la proteína jam-A asociada a la unión apretada a la permeabilidad intestinal y la transmigración de neutrófilos15,28,29,30,31.
El modelo iLoop es un método altamente funcional y fisiológico que se puede utilizar para corroborar ensayos in vitro. Además, se trata de un modelo experimental versátil que permite el estudio de diversos reactivos que se pueden inyectar en la luz del asa, incluyendo quimiocinas, citoquinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticuerpos y terapéuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los mecanismos responsables del dysregulation de la función intestinal de la barrera y del reclutamiento de la célula inmune bajo condiciones patológicas tales como IBD se entienden incompleto. Aquí, detallamos un modelo murino in vivo robusto que emplea un segmento intestinal exteriorizado bien vascularizado de íleon o colon proximal y permite la evaluación de la permeabilidad intestinal, estudios de migración de neutrófilos, así como otras aplicaciones.
El iLoop es una cirugía de n…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Sven Flemming de la Universidad de Wuerzburg por sus contribuciones al establecimiento del modelo de bucle de colon proximal, a Sean Watson por el manejo de las colonias de ratones y a Chithra K. Muraleedharan por ayudar con la adquisición de las imágenes del modelo iLoop. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación/DFG (BO 5776/2-1) a KB, R01DK079392, R01DK072564, y R01DK061379 a C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
Referenzen
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
