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Neurowissenschaften

Der Schlaf-Nullifizierungsapparat: Eine hocheffiziente Methode zur Schlafentzugs-Drosophila

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/62105
, , , ,
1Department of Neuroscience,Washington University School of Medicine

Summary

Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.

Abstract

Die Schlaföostase, die Zunahme des Schlafes, die nach Schlafverlust beobachtet wird, ist eines der definierenden Kriterien, um den Schlaf im gesamten Tierreich zu identifizieren. Infolgedessen sind Schlafentzug und Schlafeinschränkung leistungsstarke Werkzeuge, die häufig verwendet werden, um Einblicke in die Schlaffunktion zu geben. Nichtsdestotrotz sind Schlafentzugsexperimente von Natur aus problematisch, da der Entzugsreiz selbst die Ursache für beobachtete Veränderungen in Physiologie und Verhalten sein kann. Dementsprechend sollten erfolgreiche Schlafentzugstechniken die Tiere wach halten und im Idealfall zu einem robusten Schlafrebound führen, ohne auch eine Vielzahl unbeabsichtigter Folgen zu verursachen. Hier beschreiben wir eine Schlafentzugstechnik für Drosophila melanogaster. Der Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) verabreicht alle 10er Jahre einen Stimulus, um negative Geotaxis zu induzieren. Obwohl der Reiz vorhersehbar ist, verhindert der SNAP effektiv >95% des Nachtschlafs auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb. Wichtig ist, dass die nachfolgende homöostatische Reaktion der durch Handentzug erreichten sehr ähnlich ist. Das Timing und der Abstand der Reize können modifiziert werden, um den Schlafverlust zu minimieren und somit unspezifische Auswirkungen des Reizes auf Physiologie und Verhalten zu untersuchen. Der SNAP kann auch zur Schlafeinschränkung und zur Beurteilung von Erregungsschwellen eingesetzt werden. Der SNAP ist eine leistungsstarke Schlafunterbrechungstechnik, mit der die Schlaffunktion besser verstanden werden kann.

Introduction

Schlaf ist bei Tieren nahezu universell, aber seine Funktion bleibt unklar. Schlaföostase, die kompensatorische Zunahme des Schlafes nach Schlafentzug, ist eine definierende Eigenschaft des Schlafes, die verwendet wurde, um Schlafzustände bei einer Reihe von Tieren1,2,3,4,5zu charakterisieren .

Schlaf in der Fliege hat viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Schlaf, einschließlich einer robusten homöostatischen Reaktion auf Schlafverlust4,5. Zahlreiche Studien über schlaf in der Fliege haben Schlafentzug verwendet, um sowohl die Schlaffunktion abzuleiten, indem die nachteiligen Folgen eines längeren Aufwachens untersucht werden, als auch um die Schlafregulation zu verstehen, indem die neurobiologischen Mechanismen bestimmt werden, die die homöostatische Regulierung des Schlafes steuern. So wurde gezeigt, dass schlaflose Fliegen Beeinträchtigungen im Lern- und Gedächtnis aufweisen6,7,8,9,10,11,12, strukturelle Plastizität13,14,15, visuelle Aufmerksamkeit16, Erholung von neuronalen Verletzungen17,18, Paarung und aggressives Verhalten19, 20, Zellproliferation21und Reaktionen auf oxidativen Stress22,23, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus haben Untersuchungen der neurobiologischen Mechanismen, die den Rebound-Schlaf steuern, kritische Einblicke in die neuronale Maschinerie geliefert, die den Schlaf-Homöostaten8,9,23,24,25,26,27,28,29 bildet. . Schließlich haben Studien zur Schlafentzug nicht nur grundlegende Einblicke in die Schlaffunktion bei gesunden Tieren, sondern auch Erkenntnisse über die Schlaffunktion in erkrankten Zuständen30,31.

Während Schlafentzug unbestreitbar ein mächtiges Werkzeug ist, ist es bei jedem Schlafentzugsexperiment wichtig, Phänotypen, die aus längerem Aufwachen resultieren, von denen zu unterscheiden, die durch den Reiz induziert werden, der verwendet wird, um das Tier wach zu halten. Schlafentzug durch Händeentzug oder sanfte Handhabung gilt allgemein als Standard für minimal störenden Schlafentzug. Hier beschreiben wir ein Protokoll für schlafentziehende Fliegen mit dem Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Das SNAP ist ein Gerät, das alle 10Er Jahre einen mechanischen Reiz an Fliegen liefert und Fliegen wach hält, indem es negative Geotaxis induziert (Abbildung 1). Der SNAP entzieht Fliegen effizient >98% des Nachtschlafs, auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb8,32. Der SNAP wurde auf knallempfindliche Fliegen kalibriert, das Rühren von Fliegen im SNAP schadet den Fliegen nicht; Schlafentzug mit dem SNAP induziert einen Rebound, der mit dem durch Handentzug7vergleichbar ist. Der SNAP ist somit eine robuste Methode, um Fliegen zu schlafentziehen und gleichzeitig die Wirkung des erregenden Reizes zu kontrollieren.

Protocol

1. Experimentelle Vorbereitung Sammeln Sie Fliegen, während sie sich in Fläschchen verwandeln und männliche und weibliche Fliegen trennen.HINWEIS: Schlafexperimente werden häufig mit weiblichen Fliegen durchgeführt. Es ist wichtig, jungfräuliche Weibchen zu sammeln. Gepaarte Weibchen legen Eier, die zu Larven schlüpfen, was die Analyse der Daten erschwert. Hausfliegen eines geschlechts geschlechts in Gruppen von <20.HINWEIS: Die Unterbringung von Fliegen in einer sozial angereicherten U…

Representative Results

Canton S (Cs) wurde als Wildtyp-Stamm verwendet. Fliegen wurden auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan gehalten und Schlaf für 12 Stunden über Nacht entzogen. Die Untersuchung der Schlafprofile von Cs-Fliegen am Basistag (bs), am Schlafentzugstag (sd) und an zwei Erholungstagen (rec1 und rec2)(Abbildung 2A)legt nahe, dass Fliegen im SNAP effektiv Schlaf entzogen wurden und der Schlaf während des Tages im Einklang mit den beobachteten Berichten in der…

Discussion

Schlaf in Drosophila wurde unabhängig voneinander im Jahr 2000 durch zwei Gruppen4,5charakterisiert. In diesen bahnbrechenden Studien wurde Fliegen durch sanfte Handhabung (d.h. Händeentzug) des Schlafes beraubt und gezeigt, dass sie eine robuste homöostatische Reaktion auf Schlafentzug über Nacht zeigen. Wichtig ist, dass es bei jedem Schlafentzugsexperiment entscheidend ist, mögliche verwirrende Auswirkungen der Methode zu kontrollieren, mit der d…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse 5R01NS051305-14 und 5R01NS076980-08 an PJS unterstützt.

Materials

Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax Thermo Fisher 13404-122 Wax used for sealing tubes
Glass tubes Wale Apparatus 244050 We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food Genesee Scientific 66-113 Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool Dremel Multi Pro 395 Used to cut 65mm long glass tubes 
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software Trikinetics Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer Lenovo Idea Centre AIO3 A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors Trikinetics DAM2 These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor Trikinetics DEnM Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller Trikinetics LC4 A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM Trikinetics PSIU-9 Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector 7001-64PC Multicomp DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters Trikinetics SPLT5 Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire Radioshack 278-367 Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply Gw INSTEK GPS-30300 Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus Washington University School of Medicine machine shop
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Referenzen

  1. Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
  2. Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
  3. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  4. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  5. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  6. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
  7. Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
  8. Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
  9. Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
  10. Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
  11. Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
  12. Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
  13. Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
  14. Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
  15. Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
  16. Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  17. Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
  18. Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
  19. Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
  20. Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
  21. Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
  22. Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
  23. Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
  24. Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
  25. Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
  26. Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
  27. Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
  28. Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
  29. Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
  30. Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
  31. Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
  32. Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
  33. Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
  34. Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
  35. Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
  36. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
  37. Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
  38. Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
  39. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
  40. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
  41. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
  42. Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
  43. Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
  44. Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).

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Sleep DeprivationSleep RestrictionDrosophilaSleep HomeostasisSleep RegulationSNAP (Sleep Nullifying Apparatus)Activity MonitoringLocomotor ActivitySleep BoutSleep Recovery

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Melnattur, K., Morgan, E., Duong, V., Kalra, A., Shaw, P. J. The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila. J. Vis. Exp. (166), e62105, doi:10.3791/62105 (2020).
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