O aparelho de anulação do sono: um método altamente eficiente de privação do sono Drosophila
Summary
A privação do sono é uma ferramenta poderosa para investigar a função e a regulação do sono. Descrevemos um protocolo para dormir privar Drosophila usando o Aparelho de Anulação do Sono, e determinar a extensão do sono de recuperação induzido pela privação.
Abstract
A homeostase do sono, o aumento do sono observado após a perda do sono, é um dos critérios definidores utilizados para identificar o sono em todo o reino animal. Como consequência, a privação do sono e a restrição do sono são ferramentas poderosas que são comumente usadas para fornecer insights sobre a função do sono. No entanto, os experimentos de privação do sono são inerentemente problemáticos, na prática, o estímulo à privação em si pode ser a causa das mudanças observadas na fisiologia e no comportamento. Assim, técnicas bem sucedidas de privação do sono devem manter os animais acordados e, idealmente, resultar em uma recuperação robusta do sono sem também induzir um grande número de consequências não intencionais. Aqui, descrevemos uma técnica de privação do sono para Drosophila melanogaster. O Aparelho de Anulação do Sono (SNAP) administra um estímulo a cada 10 anos para induzir geotaxis negativos. Embora o estímulo seja previsível, o SNAP efetivamente evita >95% do sono noturno mesmo em moscas com alta movimentação de sono. É importante ressaltar que a resposta homeostática subsequente é muito semelhante à alcançada usando privação manual. O tempo e o espaçamento dos estímulos podem ser modificados para minimizar a perda de sono e, assim, examinar efeitos não específicos do estímulo sobre fisiologia e comportamento. O SNAP também pode ser usado para restrição de sono e para avaliar limiares de excitação. O SNAP é uma poderosa técnica de interrupção do sono que pode ser usada para entender melhor a função do sono.
Introduction
O sono é quase universal em animais, mas sua função permanece incerta. A homeostase do sono, o aumento compensatório do sono após a privação do sono, é uma propriedade definidora do sono, que tem sido usada para caracterizar estados de sono em um número de animais1,2,3,4,5.
O sono na mosca tem muitas semelhanças com o sono humano, incluindo uma resposta homeostática robusta à perda de sono4,5. Inúmeros estudos de sono na mosca têm usado a privação do sono tanto para inferir a função do sono, examinando as consequências adversas que se acumulam a partir da vigília prolongada, quanto para entender a regulação do sono, determinando os mecanismos neurobiológicos que controlam a regulação homeostática do sono. Assim, as moscas privadas de sono apresentaram prejuízos no aprendizado e na memória6,7,8,9,10,11,12, plasticidade estrutural13,14,15, atenção visual16, recuperação da lesão neuronal17,18, acasalamento e comportamentos agressivos19, 20, proliferação celular21, e respostas ao estresse oxidativo22,23 para citar alguns. Além disso, as investigações sobre os mecanismos neurobiológicos que controlam o sono de recuperação produziram insights críticos sobre a maquinaria neuronal que constitui o homeostat do sono8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Finalmente, além de revelar insights fundamentais sobre a função do sono em animais saudáveis, estudos de privação do sono também informaram insights sobre a função do sono em estados doentes30,31.
Embora a privação do sono seja inegavelmente uma ferramenta poderosa, com qualquer experimento de privação do sono, é importante distinguir fenótipos que resultam de um aumento prolongado, daqueles induzidos pelo estímulo usado para manter o animal acordado. A privação do sono por privação manual ou manuseio suave, é geralmente considerada como estabelecendo o padrão para privação de sono minimamente disruptiva. Aqui descrevemos um protocolo para o sono privando moscas usando o Aparelho de Anulação do Sono (SNAP). O SNAP é um dispositivo que fornece um estímulo mecânico para moscas a cada 10 anos, mantendo as moscas acordadas induzindo geotaxis negativos(Figura 1). O SNAP priva eficientemente moscas de >98% do sono noturno, mesmo em moscas com alta movimentação de sono8,32. O SNAP foi calibrado em moscas sensíveis ao estrondo, a agitação das moscas no SNAP não prejudica as moscas; a privação do sono com o SNAP induz um rebote comparável ao obtido por privação manual7. O SNAP é, portanto, um método robusto para dormir privar moscas enquanto controla os efeitos do estímulo estimulante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sono em Drosophila foi caracterizado independentemente em 2000, por dois grupos4,5. Nestes estudos pioneiros, as moscas foram privadas do sono por manuseio suave (ou seja, privação de mão) e mostraram uma resposta homeostática robusta à privação do sono durante a noite. É importante ressaltar que, com qualquer experimento de privação do sono, é crucial controlar os potenciais efeitos de confusão do método usado para manter o animal acordad…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH 5R01NS051305-14 e 5R01NS076980-08 para PJS.
Materials
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
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