استئصال الورم المشتق من المريض كمنصة "حية" قبل السريرية للتنبؤ بمقاومة الأدوية لدى المرضى
Summary
تصف هذه الورقة أساليب توليد العلاج الدوائي وتحليل النباتات المشتقة من المريض لتقييم استجابات أدوية الورم في نظام نموذج حي ومناسب للمريض قبل السريرية.
Abstract
إن فهم مقاومة الأدوية ووضع استراتيجيات جديدة لتوعية السرطانات شديدة المقاومة يعتمدان على توافر نماذج مناسبة قبل السريرية يمكنها التنبؤ بدقة باستجابات المرضى. أحد عيوب النماذج الموجودة قبل السريرية هو عدم القدرة على الحفاظ على البيئة الدقيقة للورم البشري (TME) بشكل سياقي وتمثيل التغايرية داخل الرحم بدقة ، مما يحد من الترجمة السريرية للبيانات. وعلى النقيض من ذلك، من خلال تمثيل ثقافة الشظايا الحية للأورام البشرية، تسمح منصة التشميل المشتقة من المريض (PDE) بفحص استجابات الأدوية في سياق ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) يعكس السمات المرضية والمعمارية للأورام الأصلية قدر الإمكان. وقد وثقت التقارير السابقة مع PDEs قدرة المنصة على التمييز بين العلاج الكيميائي الحسي من الأورام الكيميائية ، وقد ثبت أن هذا الفصل هو تنبؤي باستجابات المرضى لنفس العلاج الكيميائي. وفي الوقت نفسه، تتيح أجهزة مكافحة الأمراض الوراثية الفرصة لاستجواب السمات الجزيئية والوراثية والهسولوجية للأورام التي تتنبأ بالاستجابات الدوائية، وبالتالي تحديد المؤشرات الحيوية لتقسيم المرضى إلى طبقات فضلا عن النهج التدخلية الجديدة لتوعية الأورام المقاومة. هذه الورقة تقارير منهجية PDE بالتفصيل، من جمع عينات المرضى من خلال لتحليل نقطة النهاية. وهو يقدم وصفا مفصلا لأساليب الاشتقاق والثقافة التفسيرية ، وتسليط الضوء على الظروف المخصصة لأورام معينة ، عند الاقتضاء. لتحليل نقطة النهاية ، هناك تركيز على تعدد المناعة والتصوير متعدد الأطياف للتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية الرئيسية داخل كل من المناطق الورمية والسترومالية. ومن خلال الجمع بين هذه الأساليب، يمكن توليد بيانات كمية ونوعية للاستجابة للأدوية يمكن ربطها بمختلف البارامترات الباثولوجية العيادية، وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد العلامات البيولوجية.
Introduction
ويتطلب تطوير عوامل فعالة وآمنة مضادة للانسان نماذج مناسبة قبل السريرية يمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة لآليات العمل التي يمكن أن تسهل تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية والدوائية. بين وبين التجانس داخل التومور1،2،3،4،5 و TME6،7،8،9،10،11،12 معروفة للتأثير على استجابات الأدوية المضادة للسرطان ، والعديد من نماذج السرطان الموجودة قبل السريرية مثل خطوط الخلايا ، organoids ، ونماذج الماوس ليست قادرة على استيعاب هذه الاستجابات بشكل كامل حاسم ملامح. النموذج “المثالي” هو النموذج الذي يمكن أن يلخص التفاعلات المكانية المعقدة للخلايا الخبيثة غير الخبيثة داخل الأورام وكذلك يعكس الاختلافات الإقليمية داخل الأورام. تركز هذه المقالة على PDEs كمنصة ناشئة يمكنها تلبية العديد من هذه المتطلبات13.
يرجع أول مثال على استخدام PDEs البشرية ، والمعروف أيضا باسم زراعة الهستو ، إلى أواخر الثمانينيات عندما قام هوفمان وآخرون بتوليد شرائح من الأورام البشرية الطازجة واستزراعها في مصفوفة الكولاجين14،15. وشمل ذلك إنشاء نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد يحافظ على بنية الأنسجة، ويضمن الحفاظ على المكونات السترومالية وتفاعلات الخلايا داخل TME. دون تفكيك الورم الأصلي، هوفمان وآخرون16 بشرت نهجا جديدا للبحوث التحويلية، ومنذ هذا الوقت، وقد الأمثل العديد من المجموعات أساليب مختلفة explant بهدف الحفاظ على سلامة الأنسجة وتوليد بيانات دقيقة استجابة المخدرات17،18،19،20،21،22،24 ، على الرغم من أن بعض الاختلافات بين البروتوكولات واضحة. بتلر وآخرون المستزرعة explants في الإسفنج الجيلاتين للمساعدة في نشر المواد الغذائية والأدوية من خلال عينة20،21،25، في حين أن Majumder وآخرون خلق نظام بيئي الورم عن طريق زراعة explants على رأس مصفوفة تتكون من الورم والبروتينات سترومال في وجود مصل أوتولوجوس المستمدة من نفس المريض22، 23.
في الآونة الأخيرة ، وضعت مجموعتنا بروتوكولا يتم بموجبه إنشاء النباتات الخارجية عن طريق تجزئة الأورام إلى قطع بحجم 2 – 3 مم3– يتم وضعها بعد ذلك دون مكونات إضافية على أغشية نفاذية في واجهة الهواء السائل لنظام الثقافة24. وقد أظهرت هذه الدراسات العديدة مجتمعة أن PDEs تسمح بثقافة الأجزاء الحية السليمة من الأورام البشرية التي تحتفظ بالعمارة المكانية وعدم التجانس الإقليمي للأورام الأصلية. في التجارب الأصلية، كانت النباتات أو النباتات النسيجية تخضع عادة للتجانس بعد العلاج من المخدرات، وبعد ذلك تم تطبيق مختلف المقايسات الجدوى على عينات متجانسة مثل الهيدروجينيلترات المخدرات استجابة المقايسة20،21، و MTT (3-(6) – 2،5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) المقايسة ، وdhydrogenase اللاكتات المقايسة ، أو المقايسة القائمة على الريزازورين26،27،28 . التقدم الأخير في تقنيات تحليل نقطة النهاية ، وخاصة علم الأمراض الرقمي ، قد وسع الآن ذخيرة اختبارات نقطة النهاية والمقاسات التي يمكن إجراؤها على explants29،30. لتطبيق هذه التقنيات الجديدة، بدلا من التجانس، يتم إصلاح النباتات في الفورماليين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) ومن ثم تحليلها باستخدام تقنيات الاحتواء المناعي، مما يسمح التنميط المكاني. وقد تم توثيق أمثلة على هذا النهج لسرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)، وسرطان الثدي، سرطان القولون والمستقيم، وورم الظهارة المتوسطة النباتات التي بموجبها تلطيخ المناعية الكيميائية لعلامة الانتشار، Ki67، وعلامة أبوبتوتيك، مشقوق بولي ADP الريبوز بوليمراز (cPARP)، واستخدمت لرصد التغيرات في انتشار الخلايا وموت الخلية24،31،32،33،34.
متعددة immunofluorescence قابلة بشكل خاص للتنميط المكاني للاستجابات المخدرات في explants عند نقطة النهاية35. على سبيل المثال ، من الممكن قياس إعادة توطين وتوزيع مكاني لفئات محددة من الخلايا المناعية ، مثل الضامة أو الخلايا التائية ، داخل TME عند العلاج الدوائي13و36و37و38، والتحقيق فيما إذا كان العامل العلاجي يمكن أن يفضل الانتقال من “الورم البارد” إلى “الورم الساخن”39 . في السنوات الأخيرة ، ركزت هذه المجموعة على اشتقاق PDEs من أنواع الأورام المختلفة (NSCLC ، سرطان الكلى ، سرطان الثدي ، سرطان القولون والمستقيم ، سرطان الميلانوما) واختبار مجموعة من عوامل مضادة للسرطان بما في ذلك العلاج الكيميائي ، ومثبطات الجزيئات الصغيرة ، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs). وقد تم تحسين أساليب تحليل نقطة النهاية لتشمل تعدد المناعة للسماح بالتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية من أجل الجدوى وكذلك المؤشرات الحيوية لمختلف مكونات TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة طرق توليد الأدوية وعلاجها وتحليلها وتسلط الضوء على مزايا المنصة كنظام نموذجي قبل السريري. ex vivo زراعة ورم استئصالها حديثا، والتي لا تنطوي على تفكيكها، ويسمح للاحتفاظ بنية الورم13،24، وبالتالي، والتفاعلات المكانية للمكونات الخلوية في TME وكذلك ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الجراحين وأخصائيي علم الأمراض في المستشفيات الجامعية في ليستر NHS Trust على توفير أنسجة الورم الجراحية التي تم استئصالها. نشكر أيضا منشأة الأنسجة داخل خدمات التكنولوجيا الحيوية الأساسية للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجزؤ كتل أنسجة FFPE وKees Straatman لدعمها باستخدام Vectra Polaris. تم دعم وتمويل هذا البحث من قبل اتحاد Explant الذي يضم أربعة شركاء: جامعة ليستر ، ووحدة السموم MRC ، ومختبرات اكتشاف السرطان في المملكة المتحدة العلاجية ، و LifeArc. وقدم مركز CRUK-NIHR ليستر التجريبي لطب السرطان دعما إضافيا (C10604/A25151). تم توفير التمويل لجنرال موتورز، CD، وNA من قبل برنامج محفز سرطان الثدي الآن (2017NOVPCC1066)، الذي يدعمه التمويل من شركة فايزر.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
Referenzen
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Krebsforschung. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
