تصف هذه الورقة أساليب توليد العلاج الدوائي وتحليل النباتات المشتقة من المريض لتقييم استجابات أدوية الورم في نظام نموذج حي ومناسب للمريض قبل السريرية.
إن فهم مقاومة الأدوية ووضع استراتيجيات جديدة لتوعية السرطانات شديدة المقاومة يعتمدان على توافر نماذج مناسبة قبل السريرية يمكنها التنبؤ بدقة باستجابات المرضى. أحد عيوب النماذج الموجودة قبل السريرية هو عدم القدرة على الحفاظ على البيئة الدقيقة للورم البشري (TME) بشكل سياقي وتمثيل التغايرية داخل الرحم بدقة ، مما يحد من الترجمة السريرية للبيانات. وعلى النقيض من ذلك، من خلال تمثيل ثقافة الشظايا الحية للأورام البشرية، تسمح منصة التشميل المشتقة من المريض (PDE) بفحص استجابات الأدوية في سياق ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) يعكس السمات المرضية والمعمارية للأورام الأصلية قدر الإمكان. وقد وثقت التقارير السابقة مع PDEs قدرة المنصة على التمييز بين العلاج الكيميائي الحسي من الأورام الكيميائية ، وقد ثبت أن هذا الفصل هو تنبؤي باستجابات المرضى لنفس العلاج الكيميائي. وفي الوقت نفسه، تتيح أجهزة مكافحة الأمراض الوراثية الفرصة لاستجواب السمات الجزيئية والوراثية والهسولوجية للأورام التي تتنبأ بالاستجابات الدوائية، وبالتالي تحديد المؤشرات الحيوية لتقسيم المرضى إلى طبقات فضلا عن النهج التدخلية الجديدة لتوعية الأورام المقاومة. هذه الورقة تقارير منهجية PDE بالتفصيل، من جمع عينات المرضى من خلال لتحليل نقطة النهاية. وهو يقدم وصفا مفصلا لأساليب الاشتقاق والثقافة التفسيرية ، وتسليط الضوء على الظروف المخصصة لأورام معينة ، عند الاقتضاء. لتحليل نقطة النهاية ، هناك تركيز على تعدد المناعة والتصوير متعدد الأطياف للتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية الرئيسية داخل كل من المناطق الورمية والسترومالية. ومن خلال الجمع بين هذه الأساليب، يمكن توليد بيانات كمية ونوعية للاستجابة للأدوية يمكن ربطها بمختلف البارامترات الباثولوجية العيادية، وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد العلامات البيولوجية.
ويتطلب تطوير عوامل فعالة وآمنة مضادة للانسان نماذج مناسبة قبل السريرية يمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة لآليات العمل التي يمكن أن تسهل تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية والدوائية. بين وبين التجانس داخل التومور1،2،3،4،5 و TME6،7،8،9،10،11،12 معروفة للتأثير على استجابات الأدوية المضادة للسرطان ، والعديد من نماذج السرطان الموجودة قبل السريرية مثل خطوط الخلايا ، organoids ، ونماذج الماوس ليست قادرة على استيعاب هذه الاستجابات بشكل كامل حاسم ملامح. النموذج “المثالي” هو النموذج الذي يمكن أن يلخص التفاعلات المكانية المعقدة للخلايا الخبيثة غير الخبيثة داخل الأورام وكذلك يعكس الاختلافات الإقليمية داخل الأورام. تركز هذه المقالة على PDEs كمنصة ناشئة يمكنها تلبية العديد من هذه المتطلبات13.
يرجع أول مثال على استخدام PDEs البشرية ، والمعروف أيضا باسم زراعة الهستو ، إلى أواخر الثمانينيات عندما قام هوفمان وآخرون بتوليد شرائح من الأورام البشرية الطازجة واستزراعها في مصفوفة الكولاجين14،15. وشمل ذلك إنشاء نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد يحافظ على بنية الأنسجة، ويضمن الحفاظ على المكونات السترومالية وتفاعلات الخلايا داخل TME. دون تفكيك الورم الأصلي، هوفمان وآخرون16 بشرت نهجا جديدا للبحوث التحويلية، ومنذ هذا الوقت، وقد الأمثل العديد من المجموعات أساليب مختلفة explant بهدف الحفاظ على سلامة الأنسجة وتوليد بيانات دقيقة استجابة المخدرات17،18،19،20،21،22،24 ، على الرغم من أن بعض الاختلافات بين البروتوكولات واضحة. بتلر وآخرون المستزرعة explants في الإسفنج الجيلاتين للمساعدة في نشر المواد الغذائية والأدوية من خلال عينة20،21،25، في حين أن Majumder وآخرون خلق نظام بيئي الورم عن طريق زراعة explants على رأس مصفوفة تتكون من الورم والبروتينات سترومال في وجود مصل أوتولوجوس المستمدة من نفس المريض22، 23.
في الآونة الأخيرة ، وضعت مجموعتنا بروتوكولا يتم بموجبه إنشاء النباتات الخارجية عن طريق تجزئة الأورام إلى قطع بحجم 2 – 3 مم3– يتم وضعها بعد ذلك دون مكونات إضافية على أغشية نفاذية في واجهة الهواء السائل لنظام الثقافة24. وقد أظهرت هذه الدراسات العديدة مجتمعة أن PDEs تسمح بثقافة الأجزاء الحية السليمة من الأورام البشرية التي تحتفظ بالعمارة المكانية وعدم التجانس الإقليمي للأورام الأصلية. في التجارب الأصلية، كانت النباتات أو النباتات النسيجية تخضع عادة للتجانس بعد العلاج من المخدرات، وبعد ذلك تم تطبيق مختلف المقايسات الجدوى على عينات متجانسة مثل الهيدروجينيلترات المخدرات استجابة المقايسة20،21، و MTT (3-(6) – 2،5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) المقايسة ، وdhydrogenase اللاكتات المقايسة ، أو المقايسة القائمة على الريزازورين26،27،28 . التقدم الأخير في تقنيات تحليل نقطة النهاية ، وخاصة علم الأمراض الرقمي ، قد وسع الآن ذخيرة اختبارات نقطة النهاية والمقاسات التي يمكن إجراؤها على explants29،30. لتطبيق هذه التقنيات الجديدة، بدلا من التجانس، يتم إصلاح النباتات في الفورماليين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) ومن ثم تحليلها باستخدام تقنيات الاحتواء المناعي، مما يسمح التنميط المكاني. وقد تم توثيق أمثلة على هذا النهج لسرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)، وسرطان الثدي، سرطان القولون والمستقيم، وورم الظهارة المتوسطة النباتات التي بموجبها تلطيخ المناعية الكيميائية لعلامة الانتشار، Ki67، وعلامة أبوبتوتيك، مشقوق بولي ADP الريبوز بوليمراز (cPARP)، واستخدمت لرصد التغيرات في انتشار الخلايا وموت الخلية24،31،32،33،34.
متعددة immunofluorescence قابلة بشكل خاص للتنميط المكاني للاستجابات المخدرات في explants عند نقطة النهاية35. على سبيل المثال ، من الممكن قياس إعادة توطين وتوزيع مكاني لفئات محددة من الخلايا المناعية ، مثل الضامة أو الخلايا التائية ، داخل TME عند العلاج الدوائي13و36و37و38، والتحقيق فيما إذا كان العامل العلاجي يمكن أن يفضل الانتقال من “الورم البارد” إلى “الورم الساخن”39 . في السنوات الأخيرة ، ركزت هذه المجموعة على اشتقاق PDEs من أنواع الأورام المختلفة (NSCLC ، سرطان الكلى ، سرطان الثدي ، سرطان القولون والمستقيم ، سرطان الميلانوما) واختبار مجموعة من عوامل مضادة للسرطان بما في ذلك العلاج الكيميائي ، ومثبطات الجزيئات الصغيرة ، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs). وقد تم تحسين أساليب تحليل نقطة النهاية لتشمل تعدد المناعة للسماح بالتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية من أجل الجدوى وكذلك المؤشرات الحيوية لمختلف مكونات TME.
تصف هذه الورقة طرق توليد الأدوية وعلاجها وتحليلها وتسلط الضوء على مزايا المنصة كنظام نموذجي قبل السريري. ex vivo زراعة ورم استئصالها حديثا، والتي لا تنطوي على تفكيكها، ويسمح للاحتفاظ بنية الورم13،24، وبالتالي، والتفاعلات المكانية للمكونات الخلوية في TME وكذلك ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الجراحين وأخصائيي علم الأمراض في المستشفيات الجامعية في ليستر NHS Trust على توفير أنسجة الورم الجراحية التي تم استئصالها. نشكر أيضا منشأة الأنسجة داخل خدمات التكنولوجيا الحيوية الأساسية للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجزؤ كتل أنسجة FFPE وKees Straatman لدعمها باستخدام Vectra Polaris. تم دعم وتمويل هذا البحث من قبل اتحاد Explant الذي يضم أربعة شركاء: جامعة ليستر ، ووحدة السموم MRC ، ومختبرات اكتشاف السرطان في المملكة المتحدة العلاجية ، و LifeArc. وقدم مركز CRUK-NIHR ليستر التجريبي لطب السرطان دعما إضافيا (C10604/A25151). تم توفير التمويل لجنرال موتورز، CD، وNA من قبل برنامج محفز سرطان الثدي الآن (2017NOVPCC1066)، الذي يدعمه التمويل من شركة فايزر.
Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |