Espianti tumorali derivati dal paziente come piattaforma preclinica "live" per prevedere la resistenza ai farmaci nei pazienti

Summary

Questo documento descrive i metodi per la generazione, il trattamento farmacologico e l’analisi di espianti derivati dal paziente per valutare le risposte ai farmaci tumorali in un sistema modello preclinico vivo, rilevante per il paziente.

Abstract

La comprensione della resistenza ai farmaci e lo sviluppo di nuove strategie per sensibilizzare i tumori altamente resistenti si basano sulla disponibilità di modelli preclinici adatti in grado di prevedere con precisione le risposte dei pazienti. Uno degli svantaggi dei modelli preclinici esistenti è l’incapacità di preservare contestualmente il microambiente tumorale umano (TME) e rappresentare accuratamente l’eterogeneità intratumorale, limitando così la traduzione clinica dei dati. Al contrario, rappresentando la coltura di frammenti vivi di tumori umani, la piattaforma di espianto derivato dal paziente (PDE) consente di esaminare le risposte ai farmaci in un contesto tridimensionale (3D) che rispecchia il più possibile le caratteristiche patologiche e architettoniche dei tumori originali. Precedenti rapporti con PDE hanno documentato la capacità della piattaforma di distinguere i tumori chemiosensibili da quelli chemioresistenti, ed è stato dimostrato che questa segregazione è predittiva delle risposte dei pazienti alle stesse chemioterapie. Allo stesso tempo, le PDE consentono l’opportunità di interrogare le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche dei tumori che predicono le risposte ai farmaci, identificando così i biomarcatori per la stratificazione del paziente e nuovi approcci interventistici per sensibilizzare i tumori resistenti. Questo documento riporta in dettaglio la metodologia PDE, dalla raccolta di campioni di pazienti fino all’analisi degli endpoint. Fornisce una descrizione dettagliata della derivazione dell’espianto e dei metodi di coltura, evidenziando le condizioni su misura per particolari tumori, se del caso. Per l’analisi degli endpoint, ci si concentra sull’immunofluorescenza multiplexata e sull’imaging multispettrale per la profilazione spaziale di biomarcatori chiave all’interno di entrambe le regioni tumorali e stromali. Combinando questi metodi, è possibile generare dati quantitativi e qualitativi sulla risposta ai farmaci che possono essere correlati a vari parametri clinicopatologici e quindi potenzialmente utilizzati per l’identificazione dei biomarcatori.

Introduction

Lo sviluppo di agenti antitumorali efficaci e sicuri richiede modelli preclinici appropriati che possano anche fornire informazioni sui meccanismi d’azione che possono facilitare l’identificazione di biomarcatori predittivi e farmacodinamici. L’eterogeneitàinter- e intratumorale^{1,2,3,4, 5} e la TME^{6,7,8,9,10, 11,12}sono note per influenzare le risposte ai farmaci antitumorali e molti modelli di cancro preclinico esistenti come linee cellulari, organoidi e modelli murini non sono in grado di accogliere pienamente questi cruciali tratti somatici. Un modello “ideale” è quello che può ricapitolare le complesse interazioni spaziali di cellule maligne con cellule non maligne all’interno dei tumori e riflettere le differenze regionali all’interno dei tumori. Questo articolo si concentra sulle PDE come piattaforma emergente in grado di soddisfare molti di questi requisiti¹³.

Il primo esempio dell’uso di PDE umane, note anche come istocolture, risale alla fine degli anni 1980 quando Hoffman et al. generarono fette di tumori umani appena resecati e li coltivarono in una matrice di collagene^14,15. Ciò ha comportato la creazione di un sistema di coltura 3D che ha preservato l’architettura dei tessuti, garantendo il mantenimento dei componenti stromali e delle interazioni cellulari all’interno della TME. Senza decostruire il tumore originale, Hoffman et al.¹⁶ hanno annunciato un nuovo approccio di ricerca traslazionale e, da questo momento, molti gruppi hanno ottimizzato diversi metodi di espianto con l’obiettivo di preservare l’integrità del tessuto e generare dati accurati sulla risposta ai farmaci^{17,18, 19,20,21,22,23,24} , anche se alcune differenze tra i protocolli sono evidenti. Butler et al. hanno coltivato espianti in spugne di gelatina per aiutare la diffusione di nutrienti e farmaci attraverso il campione^20,21,25,mentre Majumder et al. hanno creato un ecosistema tumorale coltivando espianti su una matrice composta da proteine tumorali e stromali in presenza di siero autologo derivato dallo stesso paziente^{22, 23}.

Più recentemente, il nostro gruppo ha istituito un protocollo in base al quale gli espianti sono generati dalla frammentazione dei tumori in pezzi di dimensioni 2 – 3 mm³che vengono poi posizionati senza componenti aggiuntivi su membrane permeabili all’interfaccia aria-liquido di un sistema di^{coltura 24}. Nel loro insieme, questi numerosi studi hanno dimostrato che le PDE consentono la coltura di frammenti intatti e vivi di tumori umani che conservano l’architettura spaziale e l’eterogeneità regionale dei tumori originali. Negli esperimenti originali, gli espianti o le istocolture venivano solitamente sottoposti a omogeneizzazione dopo il trattamento farmacologico, dopo di che sono stati applicati vari saggi di vitalità ai campioni omogeneizzati come il saggio di risposta ai farmaci in^{istocoltura 20,21}, il saggio MTT (3-(6) -2,5-difeniltetrazolio bromuro), il saggio della lattato deidrogenasi o il saggio a base di resazurina^26,27,28 . I recenti progressi nelle tecniche di analisi degli endpoint, in particolare la patologia digitale, hanno ora ampliato il repertorio di test e saggi endpoint che possono essere eseguiti su espianti^29,30. Per applicare queste nuove tecnologie, invece dell’omogeneizzazione, gli espianti vengono fissati in formalina, incorporati nella paraffina (FFPE) e quindi analizzati utilizzando tecniche di immunocolorazione, consentendo la profilazione spaziale. Esempi di questo approccio sono stati documentati per il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), il cancro al seno, il cancro del colon-retto e gli espianti di mesotelioma, per cui la colorazione immunoistochimica per il marcatore di proliferazione, Ki67, e il marcatore apoptotico, la poli-ADP ribosio polimerasi scissa (cPARP), è stata utilizzata per monitorare i cambiamenti nella proliferazione cellulare e la morte cellulare^{24,31,32,33,34.}

L’immunofluorescenza multiplexata è particolarmente suscettibile per la profilazione spaziale delle risposte ai farmaci negli espianti all’endpoint^35. Ad esempio, è possibile misurare la rilocalizzazione e la distribuzione spaziale di specifiche classi di cellule immunitarie, come macrofagi o cellule T, all’interno della TME dopo il trattamento farmacologico^13,36,37,38,e indagare se un agente terapeutico può favorire il passaggio da “tumore freddo” a “tumore caldo”³⁹ . Negli ultimi anni, questo gruppo si è concentrato sulla derivazione di PDE da diversi tipi di tumore (NSCLC, cancro renale, cancro al seno, cancro del colon-retto, melanoma) e sulla sperimentazione di una serie di agenti antitumorali tra cui chemioterapie, inibitori di piccole molecole e inibitori del checkpoint immunitario (ICO). I metodi di analisi degli endpoint sono stati ottimizzati per includere l’immunofluorescenza multiplexata per consentire la profilazione spaziale dei biomarcatori per la vitalità e dei biomarcatori per i diversi costituenti della TME.

Protocol

1. Raccolta dei tessuti Dopo l’intervento chirurgico, trasferire campioni di tumore umano appena resecati in un tubo contenente 25 ml di terreno di coltura fresco (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco integrato con 4,5 g / L di glucosio e L-glutammina + 1% (v / v) siero fetale del vitello + 1% di penicillina-streptomicina) e conservato su ghiaccio. Elaborare l’espianto entro 2 ore dall’intervento chirurgico in una cappa sterile di classe II. 2. Preparazi…

Representative Results

L’imaging multispettrale di sezioni istologiche colorate con mIF consente l’identificazione e la fenotipizzazione di singole popolazioni cellulari e l’identificazione di componenti tumorali e stromali nell’espianto TME (Figura 2). L’imaging multispettrale è particolarmente utile per l’analisi di tessuti ad alta autofluorescenza intrinseca, come tessuti ad alto contenuto di collagene, in quanto consente di deconvolure il segnale di autofluorescenza da altri segnali ed escluderlo da analisi s…

Discussion

Questo documento descrive i metodi per la generazione, il trattamento farmacologico e l’analisi delle PDE ed evidenzia i vantaggi della piattaforma come sistema modello preclinico. La coltivazione ex vivo di un tumore appena resecato, che non comporta la sua decostruzione, consente la ritenzione dell’architettura tumorale^13,24 e, quindi, le interazioni spaziali dei componenti cellulari nella TME e l’eterogeneità intratumorale. Questo metodo dimostra come, utiliz…

Materials

Acetic acid	Sigma	320099	Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x	Perkin Elmer	ARD1001EA	Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond	Barnstead		Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate	Sigma-Aldrich	C7129	Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates	Corning Incorporated	3516	6 multiwell plate
DAPI Dilactate	Life Technologies	D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350	100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate	Gibco (Life Technologies)	10569-010	Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant	VWR	360294H	Mounting medium
DPX mountant	Merck	6522	Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	Reagent for TE buffer
Eosin	CellPath	RBC-0100-00A	Staining reagent
Foetal Bovine Serum	Gibco	10500-064	For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde	Fisher (Acros)	119690010	10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095	iGenix	IG2095	Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)	Genta Medical	199050	99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software	Akoya Biosciences	InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor	Leica Biosystems		Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C	Leica Biosystems		Embedding wax bath
Leica RM2125RT	Leica Biosystems		Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer	Leica Biosystems		H&E stainer
Mayer's Haematoxylin	Sigma	GHS132-1L	Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Merck Milipore	PICMORG50	Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System	Leica Biosystems	RE7150-K	DAB staining kit
OPAL 480	Akoya Biosciences	FP1500001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent	Akoya Biosciences	FP1501001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x	Perkin Elmer	ARH1001EA	HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution	Fisher Scientific	11548876	For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer	Akoya Biosciences	PhenoChart	Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets	Thermo Scientific Oxoid	BR0014G	PBS
1x Plus Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36961	Mounting medium
Slide Carrier	Perkin Elmer		To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S/3160/63	10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets	Fisher Scientific	S/4920/53	Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g)	KEMDENT	1-601	Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center	Fisher Scientific	10098889	Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates	Fisher Scientific	11927774	Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	252859	Reagent for TE buffer
VectaShield	Vecta Laboratories	H-1000-10	Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner	Perkin Elmer	Vectra Polaris	Slide scanner
Xylene	Genta Medical	XYL050	De-waxing agent