3D-Bildgebung von PDL-Kollagenfasern während kieferorthopädischer Zahnbewegungen im Unterkiefermine modell
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen und Methoden zur 3D-Visualisierung der Kollagenfasern und Blutgefäße von Parodontalbändern ohne Schnitt.
Abstract
Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess des veränderten Weich- und Hartgewebeumbaus als Folge äußerer Kräfte. Um diese komplexen Umbauprozesse zu verstehen, ist es wichtig, das Zahn- und Parodontalgewebe in ihrem 3D-Kontext zu untersuchen und somit Schnitte und Gewebeartefakte zu minimieren. Mausmodelle werden aufgrund ihrer geringen Größe, hohen Stoffwechselrate, Genetik und einfachen Handhabung häufig in der Entwicklungs- und Strukturbiologie sowie in der Biomechanik eingesetzt. Prinzipiell sind sie damit auch hervorragende Modelle für zahnärztliche Studien. Ein großes Hindernis ist jedoch ihre geringe Zahngröße, insbesondere die Backenzähne. Dieses Papier zielt darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen und zwei Methoden zur 3D-Bildgebung der parodontalen Bandfaserkomponente eines Maus-Unterkiefermolaren bereitzustellen. Die erste vorgestellte Methode basiert auf einem Mikro-CT-Setup, das die Phasenverstärkungsbildgebung von frischem Kollagengewebe ermöglicht. Die zweite Methode ist eine Knochenreinigungsmethode mit Ethylzimt, die eine Bildgebung durch den Knochen ohne Schnitt ermöglicht und die endogene Fluoreszenz bewahrt. Kombination dieser Clearing-Methode mit Reportermäusen wie Flk1–Cre; TdTomato bot eine erste Gelegenheit seiner Art, das 3D-Gefäßsystem in der PDL und im Alveolarknochen abbilden zu können.
Introduction
Der grundlegende biologische Prozess in der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) ist der Knochenumbau. Der Auslöser für diesen Umbauprozess wird auf Veränderungen in der Struktur des Parodontalbandes (PDL) wie extrazellulären Matrix (ECM) Stress, Nekrose sowie Blutgefäßzerstörung und -bildung zurückgeführt1,2,3. Andere mögliche Auslöser für den Alveolarknochenumbau sind die Krafterfassung durch Osteozyten im Knochen sowie die mechanische Verformung des Alveolarknochens selbst; ihre Rolle im OTM ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt4,5.
Trotz vieler Studien, die darauf abzielten, Struktur-Funktions-Beziehungen der PDL während der OTM aufzudecken, muss noch ein klarer funktioneller Mechanismus definiert werden6,7. Der Hauptgrund dafür ist die Herausforderung, Daten eines Weichgewebes (PDL) zwischen zwei Hartgeweben (Zement und Alveolarknochen) abzurufen. Die akzeptierten Methoden zum Sammeln von Strukturinformationen erfordern in der Regel Fixierungen und Abschnitte, die die PDL-Struktur stören und modifizieren. Darüber hinaus liefern die meisten dieser Methoden 2D-Daten, die, selbst wenn sie nicht verzerrt sind, nur teilweise und lokalisierte Informationen liefern. Da die PDL in ihrer Struktur und Funktion nicht einheitlich ist, ist ein Ansatz gerechtfertigt, der die intakte 3D-Struktur des gesamten Zahn-PDL-Knochenkomplexes adressiert.
In diesem Artikel werden eine Methode zur Erzeugung eines OTM in Mäusen und zwei Methoden beschrieben, die eine 3D-Visualisierung der Kollagenfasern in der PDL ohne Schnitt der Probe ermöglichen.
Murine Modelle werden häufig für In-vivo-Experimente in der Medizin, Entwicklungsbiologie, Medikamentenabgabe und Strukturstudien verwendet. Sie können genetisch verändert werden, um bestimmte Proteine und Funktionen zu eliminieren oder zu verbessern. sie bieten eine schnelle, wiederholbare und vorhersehbare Entwicklungskontrolle; Sie sind auch aufgrund ihrer geringen Größe 8 leichtabbildbar. Trotz ihrer vielen Vorteile werden Mausmodelle in der Zahnforschung nicht häufig eingesetzt, insbesondere wenn klinische Manipulationen gerechtfertigt sind, meist aufgrund der kleinen Zähne. Tiermodelle wie Ratten9,10,11, Hunde12,13, Schweine14,15,16 und Affen17 werden häufiger als Mäuse verwendet. Mit der jüngsten Entwicklung hochauflösender bildgebungsähnlicher Verfahren sind die Vorteile der Verwendung eines Mausmodells zur Entschlüsselung der verworrenen Prozesse im OTM zahlreich. Dieser Artikel stellt eine Methode vor, um eine mesiale Bewegung des Backenzahns im Unterkiefer mit konstanten Kraftniveaus zu erzeugen, die einen Knochenumbau auslösen. Die meisten OTM-Experimente an Nagetieren werden im Oberkiefer durchgeführt, da die Beweglichkeit des Unterkiefers und das Vorhandensein der Zunge eine weitere Komplexitätsebene hinzufügen. Der Unterkiefer hat jedoch viele Vorteile, wenn strukturelle 3D-Integrität gewünscht wird. Es kann leicht als ganzer Knochen seziert werden; bei einigen Arten kann es durch die faserige Symphyse in zwei Hemi-Unterkiefer getrennt werden; es ist kompakt, flach und enthält nur die Zähne ohne Sinusräume. Im Gegensatz dazu ist der Oberkiefer ein Teil des Schädels und eng mit anderen Organen und Strukturen verwandt, so dass umfangreiche Schnitte erforderlich sind, um den Alveolarknochen mit den zugehörigen Zähnen zu sezieren.
Unter Verwendung einer hauseigenen Feuchtigkeitskammer, die mit einem Beladungssystem in einem hochauflösenden Mikro-CT gekoppelt ist, das eine Phasenverstärkung ermöglicht, haben wir eine Methode entwickelt, um frisches faseriges Gewebe in 3D zuvisualisieren,wie zuvor beschrieben9,18 , 19,20,21,22,23. Frisches Gewebe wird unmittelbar nach dem Opfer des Tieres ohne Färbung oder Fixierung gescannt, was Gewebeartefakte sowie Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften reduziert. Diese 3D-Daten können für Verteilungs- und Richtungsanalysen der Fasern wie an anderer Stelle beschrieben verwendet werden19.
Die zweite hier vorgestellte 3D-Ganzgewebsbildgebungsmethode basiert auf der optischen Reinigung des Unterkiefers, die eine Bildgebung der PDL-Fasern durch den Knochen ohne Schnittbildung ermöglicht. Interessanterweise ermöglicht es auch die Visualisierung der Kollagenfasern des Knochens selbst, dies wird hier jedoch nicht diskutiert. Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden zur Gewebereinigung. Die erste ist die wässrige Reinigung, bei der die Probe in eine wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von mehr als 1,4 getaucht wird, entweder durch einfaches Eintauchen, Hyperhydratation oder Hydrogeleinbettung. Diese Methode ist jedoch sowohl in der Transparenz als auch in der strukturellen Erhaltung des Gewebes begrenzt und erfordert daher eine Fixierung des Gewebes. Das zweite Verfahren, das hochtransparente Proben liefert und keine Fixierung erfordert, ist das lösungsmittelbasierte Clearingverfahren24,25. Für die Unterkieferproben haben wir ein modifiziertes lösemittelbasiertes Clearingverfahren auf Basis von Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (Ethylzimt, ECi) erstellt. Diese Methode hat die Vorteile der Verwendung von ungiftigem Clearingmittel in Lebensmittelqualität, minimaler Gewebeschrumpfung und Konservierung von fluoreszierenden Proteinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Erzeugung von OTM bei Mäusen ist aufgrund der Größe, Genetik und Handhabungsvorteile sehr erwünscht. Die Verwendung des Unterkiefers bietet eine einfache Handhabung sowohl in Bezug auf die Gewebedissektion als auch auf die Probenvorbereitung und Bildgebung. Hier haben wir eine Methode vorgestellt, um OTM mit translationaler Bewegung des Zahnes im Knochen innerhalb von 7 Tagen nach OTM zu erzeugen. Mit diesem Protokoll kann die Gesamtdauer der Zahnbewegung verlängert werden, da die aktivierte Spule ein konstantes…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) unterstützt. Wir danken dem Harvard Center for Biological Imaging für die Infrastruktur und Unterstützung. Alle Zahlen werden mit biorender.com generiert.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
Referenzen
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
