만디큘러 뮤린 모델의 치열 교정 치아 운동 중 PDL 콜라겐 섬유의 3D 이미징
Summary
우리는 마우스에서 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 프로토콜과 교단없이 치주 인대의 콜라겐 섬유및 혈관의 3D 시각화방법을 제시한다.
Abstract
치열 교정 치아 운동은 외부 힘의 결과로 연하고 단단한 조직 리모델링을 변경한 복잡한 생물학적 과정입니다. 이러한 복잡한 리모델링 과정을 이해하기 위해서는 3D 컨텍스트 내에서 치아 및 치주 조직을 연구하여 단면 및 조직 동맥을 최소화하는 것이 중요합니다. 마우스 모델은 종종 개발 및 구조 생물학뿐만 아니라 작은 크기, 높은 신진 대사 속도, 유전학 및 취급의 용이성으로 인해 생체 역학에서 활용됩니다. 원칙적으로 이것은 또한 치과 관련 연구를위한 훌륭한 모델을 만듭니다. 그러나, 주요 장애물은 그들의 작은 치아 크기, 특히 어금니입니다. 이 논문은 마우스 하악 형 어어의 치주인 섬유 구성 요소의 3D 이미징을위한 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 단계 프로토콜및 두 가지 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 첫번째 방법은 신선한 콜라겐 조직의 위상 향상 화상 진찰을 가능하게 하는 마이크로 CT 설치를 기반으로 합니다. 두 번째 방법은 절개없이 뼈를 통해 이미징을 가능하게하고 내인성 형광을 보존하는 에틸 신나메이트를 사용하는 뼈 청산 방법입니다. Flk1같은 기자 마우스와이 클리어링 방법을 결합 –Cre; TdTomato는 PDL과 폐포 뼈에서 3D 혈관을 이미지화 할 수있는 최초의 기회를 제공했습니다.
Introduction
치열 교정 치아 운동 (OTM)의 기본 기본 생물학적 과정은 뼈 리모델링입니다. 이러한 리모델링 과정의 트리거는 세포외 매트릭스(ECM) 스트레스, 괴사 뿐만 아니라 혈관 파괴 및 형성1,2,3과같은 치주 인대(PDL)의 구조의 변화에 기인한다. 폐포 뼈 리모델링을 위한 다른 가능한 트리거는 골의 골세포에 의한 강제 감지뿐만 아니라 폐포 뼈 자체의 기계적 변형과 관련이 있습니다. 그러나 OTM에서의 역할은 여전히 완전히4,5를해명하지 는 않습니다.
OTM 동안 PDL의 구조 기능 관계를 밝히기 위한 많은 연구에도 불구하고 명확한 기능 적 메커니즘은 아직6,7로정의되지 않았습니다. 이에 대 한 주요 이유는 연조직 (PDL)의 데이터를 검색에 도전 이다 (시멘트와 폐포 뼈). 구조 정보를 수집하는 허용된 메서드는 일반적으로 PDL 구조를 방해하고 수정하는 고정 및 절위를 필요로 합니다. 또한 이러한 메서드의 대부분은 왜곡되지 않더라도 부분 및 지역화된 정보만 제공하는 2D 데이터를 생성합니다. PDL의 구조와 기능이 균일하지 않기 때문에 전체 치아 PDL-뼈 복합체의 그대로 3D 구조를 해결하는 접근 방식이 보증됩니다.
본 백서는 마우스에서 OTM을 생성하는 방법과 시료의 단면 없이 PDL에서 콜라겐 섬유의 3D 시각화를 가능하게 하는 두 가지 방법을 설명한다.
Murine 모델은 의학, 발달 생물학, 약물 전달 및 구조 연구에서 생체 내 실험에 널리 사용됩니다. 그(것)들은 특정 단백질 및 기능을 제거하거나 강화하기 위하여 유전으로 변형될 수 있습니다; 빠르고 반복 가능하며 예측 가능한 개발 제어를 제공합니다. 그들은 또한 때문에 작은 크기8이미지에 쉽게 8. 그들의 많은 장점에도 불구 하 고, 치과 연구에서 마우스 모델은 자주 사용 되지 않습니다., 임상 조작 보증 하는 경우에 특히, 주로 작은 크기의 치아 때문에. 쥐9,10,11,개12개,13개,돼지14개,15,16, 원숭이(17)와 같은 동물모델은 쥐보다 더 자주 사용된다. 최근 고해상도 이미징 기술이 개발되면서 OTM의 복잡한 프로세스를 해독하기 위해 마우스 모델을 활용하는 장점은 매우 많습니다. 이 논문은 뼈 리모델링을 유발하는 일정한 힘 수준으로 하악에서 어금니치아의 매혹적인 움직임을 생성하는 방법을 제시한다. 설치류에 있는 OTM 실험의 대부분은 하악의 이동성및 혀의 존재가 또 다른 복잡성 수준을 추가하기 때문에, 맥심증에서 행해지됩니다. 그러나 하악은 3D 구조적 무결성이 원할 때 많은 장점이 있습니다. 그것은 쉽게 전체 뼈로 해부 될 수있다; 일부 종에서는 섬유성 심기심을 통해 두 개의 헤미 하악으로 분리 될 수 있습니다. 컴팩트하고 평평하며 부비동 공간이 없는 치아만 들어 있습니다. 대조적으로, 맥슬아는 두개골의 일부이며 다른 장기 및 구조와 밀접하게 관련되어 있으므로 폐포 뼈를 관련 치아와 해부하기 위해 광범위한 단면이 필요합니다.
위상 향상을 가능하게 하는 고해상도 마이크로 CT 내부의 로딩 시스템에 결합된 집 습도 챔버를 사용하여, 앞서 설명한 바와 같이 3D로 신선한 섬유 조직을 시각화하는 방법을 개발하였다9,18,19,20,21,22, 23. 신선한 조직은 동물이 염색이나 고정없이 희생 된 직후 스캔되어 조직 유물과 생체 역학 적 특성의 변경을 줄입니다. 이러한 3D 데이터는 다른 곳에서 설명된 바와 같이 섬유의 분포 및 방향 분석에 활용될 수 있다19.
여기에 제시된 두 번째 3D 전체 조직 이미징 방법은 단면 없이 뼈를 통해 PDL 섬유의 이미징을 가능하게 하는 하악의 광학 클리어링을 기반으로 한다. 흥미롭게도 뼈 자체의 콜라겐 섬유의 시각화를 가능하게하지만, 이것은 여기에서 논의되지 않습니다. 일반적으로 조직 정리를 위한 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째는 간단한 침지, 과수화 또는 하이드로겔 포함을 통해 1.4보다 큰 굴절률을 가진 수성 용액에 샘플을 침지하는 수성 기반 클리어링입니다. 그러나, 이 방법은 조직의 구조적 보존뿐만 아니라 투명성의 수준에서 제한되므로 조직의 고정이 필요하다. 고투명 샘플을 산출하고 고정이 필요하지 않은 두 번째 방법은 용매 기반 클리어링방법(24,25)이다. 우리는 하악 시료에 대한 에틸-3-페닐프로프-2-에노이트(ethyl cinnamate, ECi)를 기반으로 수정된 용매 계 청산 방법을 생성하였다. 이 방법은 비독성 식품 등급 클리어링 에이전트, 최소한의 조직 수축 및 형광 단백질보존을 사용하는 장점이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스에서 OTM을 생성하는 것은 크기, 유전학 및 취급 이점으로 인해 매우 원합니다. 하악을 사용하면 조직 해부와 샘플 준비 및 이미징 측면에서 쉽게 취급할 수 있습니다. 여기서 우리는 OTM의 7 일 이내에 뼈 내부의 치아의 번역 운동으로 OTM을 생성하는 방법을 제시했습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 활성화 된 코일은 약 1mm의 움직임에 대한 일정한 힘 수준을 제공하기 때문에, 치아 운동의 전체…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH (NIDCR R00-DE025053, PI:Naveh)에 의해 지원되었다. 하버드 센터의 인프라 와 지원에 감사드립니다. 모든 수치는 biorender.com 함께 생성됩니다.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
Referenzen
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