从舌头上皮和梅森奇姆/胚胎日12.5和8周大的老鼠的结缔细胞分离
Summary
我们开发了一个通用的协议，将大量高质量的单细胞从胚胎和成年小鼠舌头的上皮和间质/结缔组织分离出来。
Abstract
细胞分离是研究单细胞水平和/或细胞群水平（例如单细胞RNA测序和原细胞培养）的重要程序。大量产生可行、健康的细胞至关重要，因此最佳条件取决于组织。舌头上皮和底层间质/结缔组织的细胞群是异质的，组织结构在不同的区域和不同的发育阶段各不相同。我们已经测试了在早期发育[胚胎日12.5（E12.5）]和年轻成人（8周）阶段从小鼠舌头上皮和间质/结缔组织分离细胞的协议。上皮和底层间质/结缔组织之间的干净分离很容易实现。然而，要进一步处理和分离细胞，大量产生可行的健康细胞，并仔细选择酶消化缓冲器、孵化时间、离心速度和时间至关重要。在 0.25% Trypsin-EDTA 中孵化分离的上皮或底层 mesenchyme/结缔组织，在 37 °C 时 30 分钟，然后在 200 x g 处进行离心 8 分钟，从而以高存活率（>90%） 获得高细胞产量无论鼠标阶段和舌头区域。此外，我们发现，胚胎和成人舌头分离的上皮细胞和间皮/结缔组织细胞都可以在基于细胞培养的介质中存活至少3小时，而不会显著降低细胞的生存能力。这些协议将用于要求在早期发育（E12.5）和年轻成人（8周）阶段从小鼠舌头中培养分离细胞的研究，这些阶段需要细胞从不同的组织隔间分离出来。
Introduction
哺乳动物的舌头是一个复杂的器官，对口感、口语和食物加工至关重要。它由多种高度组织组织组成，由夹层 / 结缔组织分割而成，并覆盖着包含味觉和味蕾的分层上皮板。舌头上皮和间质/结缔组织的细胞群是异质的。为了更好地了解舌头中特定类型细胞的功能和分布，有必要使用分离细胞进行研究。例如，单细胞RNA测序是单细胞转录分析的一种强大而高通量的方法，旨在以单细胞分辨率1、2、3、4来理解复杂组织的转录。初级细胞培养已被证明是研究干细胞/祖细胞的功能和分化的味蕾5，6的有用工具。这些研究需要大量的高质量隔离细胞群（例如，具有适当浓度和高生存能力的足够总细胞数量）。
因此，有必要从语言组织的不同区域和处于不同发育阶段的细胞分离出来。目前，没有详细的协议可用于细胞脱离舌头上皮和基础间皮/结缔组织。在这里，我们报告了一种优化的细胞分离方法，为需要高质量活细胞的实验（如单细胞RNA测序和原发干细胞培养）做准备。我们发现，选择酶消化缓冲器、温和的管道、选择悬念介质以及最佳的离心时间和速度对于产生这些大量优质细胞至关重要。
Protocol
Representative Results
Discussion
迄今为止，还没有一个详细的协议可用于细胞脱离舌头上皮和基础间皮/结缔组织。此当前细胞分离协议提供了一个可重复的程序，以产生具有高细胞生存能力的单个细胞悬架（>90%）来自小鼠舌组织，包括上皮片和胚胎和产后阶段的脑膜/结缔组织，即使E12.5和成年小鼠的分离细胞大小不同。例如，E12.5小鼠舌头上皮和中微血球的分离细胞是一致的，小的，与8周大老鼠舌头的细胞大变异（从小到大?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家卫生研究院的支持，授予编号为R01DC012308和R21DC018089至HXL。我们感谢布雷特·马歇尔（佐治亚州大学、雅典大学）和埃贡·兰基尼（10X基因组学，普莱森顿，加利福尼亚州）在细胞分离方面的技术援助和咨询;弗朗西斯卡·吉布森·伯恩利（佐治亚州雅典大学）进行英语编辑。
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
Referenzen
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