ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות
Summary
פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.
Abstract
דיסוציאציה של תאים הייתה הליך חיוני למחקרים ברמת התאים הבודדים ו/או ברמת אוכלוסיית התאים (למשל, רצף RNA של תא יחיד ותרבות תאים ראשונית). תשואת תאים בריאים ובת קיימא בכמויות גדולות היא קריטית, והתנאים האופטימליים לעשות זאת תלויים ברקמות. אוכלוסיות התאים באפיתל הלשון ורקמת החיבור הבסיסית הן הטרוגניות ומבני הרקמות משתנים באזורים שונים ובשלבים התפתחותיים שונים. בדקנו פרוטוקולים לבודד תאים מאפיתל לשון העכבר ורקמת mesenchyme / חיבור בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים [יום עוברי 12.5 (E12.5)] ומבוגר צעיר (8 שבועות). הפרדה נקייה בין האפיתל לבין רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית היה קל להשיג. עם זאת, כדי להמשיך לעבד ולבודד תאים, מניב תאים בריאים קיימא בכמויות גדולות, ובחירה זהירה של מאגר עיכול אנזימטי, זמן הדגירה, ומהירות צנטריפוגה וזמן הם קריטיים. דגירה של אפיתל מופרד או רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית ב 0.25% טריפסין-EDTA במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F), ואחריו צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות הביא תשואה גבוהה של תאים בשיעור כדאיות גבוהה (>90%) ללא קשר לשלבי העכבר ואזורי הלשון. יתר על כן, מצאנו כי הן אפיתל מנותק והן תאי רקמת mesenchymal / חיבור משפות עובריות ובוגרות יכול לשרוד במדיום מבוסס תרבות התא לפחות 3 שעות ללא ירידה משמעותית של הכדאיות התא. הפרוטוקולים יהיו שימושיים למחקרים הדורשים הכנת תאים מבודדים מלשונות עכבר בשלבים התפתחותיים מוקדמים (E12.5) ומבוגרים צעירים (8 שבועות) הדורשים ניתוק תאים מתאי רקמות שונים.
Introduction
לשון היונקים היא איבר מורכב הקריטי לטעם, דיבור ועיבוד מזון. הוא מורכב מסוגים רבים של רקמות מאורגנות מאוד ממודר על ידי mesenchyme / רקמת חיבור מכוסה על ידי גיליון אפיתל מרובד המכיל פפיליה טעם בלוטות טעם. אוכלוסיות התאים הן באפיתל הלשון והן ברקמת mesenchyme/connective הן הטרוגניות. כדי להבין טוב יותר את הפונקציות ואת ההפצה של סוג מסוים של תאים בלשון, מחקרים באמצעות תאים מנותקים נחוצים. לדוגמה, רצף RNA של תא יחיד הוא שיטה רבת עוצמה ובעלת תפוקה גבוהה לפרופיל שעתוק בתאים בודדים, אשר נועדה להבין את התמלול של רקמה מורכבת ברזולוציה של תא יחיד1,2,3,4. תרבות התאים העיקרית הוכחה ככלי שימושי לחקר הפונקציה והבידול של תאי גזע / אב לבלוטות טעם5,6. מחקרים אלה דורשים כמות גדולה של אוכלוסיות תאים מבודדים באיכות גבוהה (למשל, מספר תאים כולל מספיק עם ריכוז תקין וכדאיות גבוהה).
לכן, יש צורך לבודד תאים מאזורים שונים של הרקמות הלשונית בשלבים התפתחותיים שונים. נכון לעכשיו, אין פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת הרקמה mesenchyme / חיבור הבסיסית. כאן, אנו מדווחים על שיטת ניתוק תאים ממוטבת כדי להכין תאים לניסויים הדורשים איכות גבוהה של תאים חיים כגון עבור רצף RNA של תא יחיד ותרביות תאי גזע ראשוניות. מצאנו כי מבחר של מאגר עיכול אנזימטי, pipetting עדין, מבחר של מדיום resuspension, זמן צנטריפוגה אופטימלי ומהירות חיוניים כדי ליצור כמויות גדולות אלה של תאים באיכות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עד כה, לא היה פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת המזנצ’ימה הבסיסית / רקמת חיבור. פרוטוקול ניתוק תאים נוכחי זה מספק הליך לשחזור כדי ליצור השעיית תא בודד עם כדאיות גבוהה של תאים (>90%) מרקמות לשון העכבר, כולל יריעות אפיתל ורקמות mesenchyme / חיבור בשלבים העובריים ולאחר הלידה למרות תאי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק R01DC012308 ו R21DC018089 ל- HXL. אנו מודים לברט מרשל (אוניברסיטת ג’ורג’יה, אתונה, GA) ואגון רנגיני (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) על סיוע טכני וייעוץ לגבי ניתוק התא; כדי פרנסיסקו גיבסון ברנלי (אוניברסיטת ג’ורג’יה, אתונה, GA) לעריכה אנגלית.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
Referenzen
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
