Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

Summary

De glioomstamcellen (GSC’s) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC’s maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC’s, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

Abstract

De glioomstamcellen (GSC’s) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC’s maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC’s, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

Introduction

Glioblastoom (GBM) is het meest voorkomende en agressieve type primaire hersentumor. Momenteel is de totale overleving van GBM-patiënten die een maximale behandeling kregen (een combinatie van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie) nog steeds korter dan 15 maanden; dus nieuwe en effectieve therapieën voor GBM zijn dringend nodig.

De aanwezigheid van glioomstamcellen (GSC’s) in GBM vormt een aanzienlijke uitdaging voor de conventionele behandeling, omdat deze stamcellen een centrale rol spelen bij het behoud van tumormicro-omgeving, medicijnresistentie en tumorrecidief¹. Daarom kan het richten op GSC’s een veelbelovende strategie zijn voor GBM-behandeling². Niettemin is een groot nadeel voor de werkzaamheid van het geneesmiddel bij GBM de heterogene aard ervan, inclusief maar niet beperkt tot het verschil in genetische mutaties, gemengde subtypen, epigenetische regulatie en tumormicro-omgeving, waardoor ze zeer refractair zijn voor behandeling. Na vele mislukte klinische onderzoeken realiseerden wetenschappers en klinische onderzoekers zich dat gerichte therapie met één middel waarschijnlijk niet in staat is om de progressie van zeer heterogene kankers zoals GBM volledig te beheersen. Terwijl zorgvuldig geselecteerde medicijncombinaties zijn goedgekeurd voor hun effectiviteit door synergetisch het effect van elkaar te versterken, waardoor een veelbelovende oplossing voor GBM-behandeling wordt geboden.

Hoewel er veel manieren zijn om de geneesmiddel-geneesmiddelinteracties van een geneesmiddelcombinatie te evalueren, zoals de CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) en Bliss-waarden, enz.^3,4, zijn deze berekeningsmethoden meestal gebaseerd op combinaties van meerdere concentraties. Inderdaad, deze methoden kunnen een positieve beoordeling van de interactie tussen geneesmiddel en geneesmiddel bieden, maar kunnen zeer bewerkelijk zijn als ze worden toegepast bij screening met hoge doorvoer. Om het proces te vereenvoudigen, werd een screeningsworkflow ontwikkeld voor het snel identificeren van de potentiële medicijncombinaties die de groei van GSC’s remmen, afkomstig van chirurgische biopsieën van patiënt GBM. Een gevoeligheidsindex (SI) die het verschil van het verwachte gecombineerde effect en het waargenomen gecombineerde effect weergeeft, werd in deze methode geïntroduceerd om het synergetische effect van elk geneesmiddel te kwantificeren, zodat de potentiële kandidaten gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door de SI-ranglijst. Ondertussen demonstreert dit protocol een voorbeeldscherm om de potentiële kandidaat (en) te identificeren die het anti-glioomeffect kunnen synergiseren met temozolomide, de eerstelijns chemotherapie voor GBM-behandeling, onder 20 kleine moleculaire remmers.

Protocol

GBM-monster werd verkregen van een patiënt tijdens een routineoperatie na het verkrijgen van volledig geïnformeerde toestemming door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het First Affiliated Hospital van de Nanjing Medical University. 1. Isolatie en cultuur van patiënt-afgeleide GSC’s Plaats vers chirurgisch gereseceerd glioblastoomweefsel in een centrifugebuis van 15 ml gevuld met steriel PBS en bewaar het weefsel op ijs tot verdere operatie. Gehakt het GB…

Representative Results

De XG387-cellen vormden neurosferen in het kweekmedium beschreven in tabel 1 in een ultralage aanhechting 6-well kweekplaat of een niet-gecoate plaat5 (figuur 1A). Eerst werd een test uitgevoerd om te controleren of de bio-luminescentie-intensiteit van XG387-Luc-cellen evenredig was met het celnummer. Zoals te zien is in figuur 1B,nam de bio-luminescentie-intensiteit evenredig toe met de celdichtheid en resulteerde in een…

Discussion

In de huidige studie werd een protocol beschreven dat kan worden toegepast om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide GSC’s. In tegenstelling tot het standaard synergie/additiviteitsmetrische model zoals Loewe, BLISS of HSA-methoden, werd een eenvoudige en snelle workflow gebruikt waarbij een medicijnpaar niet op een volledige factoriële manier in meerdere concentraties moet worden gecombineerd als de traditionele methoden. In deze workflow werd SI (sensitivity index) g…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.