Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

Summary

Die Gliomstammzellen (GSCs) sind ein kleiner Teil der Krebszellen, die eine wesentliche Rolle bei der Tumorinitiierung, Angiogenese und Arzneimittelresistenz beim Glioblastom (GBM), dem häufigsten und verheerendsten primären Hirntumor, spielen. Das Vorhandensein von GSCs macht das GBM sehr refraktär gegenüber den meisten einzelnen Zielerregern, so dass Hochdurchsatz-Screening-Methoden erforderlich sind, um potenziell wirksame Kombinationstherapeutika zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt einen einfachen Workflow, um ein schnelles Screening auf eine mögliche Kombinationstherapie mit synergistischer Interaktion zu ermöglichen. Die allgemeinen Schritte dieses Workflows bestehen aus der Einrichtung von Mit Luciferase markierten GSCs, der Vorbereitung von matrigelbeschichteten Platten, dem Kombinations-Drug-Screening, der Analyse und Validierung der Ergebnisse.

Abstract

Die Gliomstammzellen (GSCs) sind ein kleiner Teil der Krebszellen, die eine wesentliche Rolle bei der Tumorinitiierung, Angiogenese und Arzneimittelresistenz beim Glioblastom (GBM), dem häufigsten und verheerendsten primären Hirntumor, spielen. Das Vorhandensein von GSCs macht das GBM sehr refraktär gegenüber den meisten einzelnen Zielerregern, so dass Hochdurchsatz-Screening-Methoden erforderlich sind, um potenziell wirksame Kombinationstherapeutika zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt einen einfachen Workflow, um ein schnelles Screening auf eine mögliche Kombinationstherapie mit synergistischer Interaktion zu ermöglichen. Die allgemeinen Schritte dieses Workflows bestehen aus der Einrichtung von Mit Luciferase markierten GSCs, der Vorbereitung von matrigelbeschichteten Platten, dem Kombinations-Drug-Screening, der Analyse und Validierung der Ergebnisse.

Introduction

Das Glioblastom (GBM) ist die häufigste und aggressivste Art von primärem Hirntumor. Derzeit ist das Gesamtüberleben von GBM-Patienten, die eine maximale Behandlung (eine Kombination aus Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie) erhalten haben, immer noch kürzer als 15 Monate; daher sind neuartige und wirksame Therapien für GBM dringend erforderlich.

Das Vorhandensein von Gliomstammzellen (GSCs) in GBM stellt eine erhebliche Herausforderung für die konventionelle Behandlung dar, da diese stammähnlichen Zellen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Tumormikroumgebung, der Arzneimittelresistenz und des Tumorrezidials spielen¹. Daher könnte die Ausrichtung auf GSCs eine vielversprechende Strategie für die GBM-Behandlung^{sein 2}. Ein großer Nachteil für die Wirksamkeit des Medikaments bei GBM ist jedoch seine heterogene Natur, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Unterschied in genetischen Mutationen, gemischten Subtypen, epigenetischer Regulation und Tumormikroumgebung, was sie für die Behandlung sehr refraktär macht. Nach vielen gescheiterten klinischen Studien erkannten Wissenschaftler und klinische Forscher, dass eine zielgerichtete Einzelwirkstofftherapie wahrscheinlich nicht in der Lage ist, das Fortschreiten von hochgradig heterogenen Krebsarten wie GBM vollständig zu kontrollieren. Während sorgfältig ausgewählte Arzneimittelkombinationen für ihre Wirksamkeit zugelassen wurden, indem sie synergistisch die Wirkung voneinander verstärken und somit eine vielversprechende Lösung für die GBM-Behandlung bieten.

Obwohl es viele Möglichkeiten gibt, die Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen einer Arzneimittelkombination zu bewerten, wie z. B. CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) und Bliss-Werte usw.^3,4, basieren diese Berechnungsmethoden in der Regel auf mehreren Konzentrationskombinationen. In der Tat können diese Methoden eine positive Bewertung der Wechselwirkung zwischen Arzneimitteln ermöglichen, können jedoch sehr mühsam sein, wenn sie im Hochdurchsatz-Screening angewendet werden. Um den Prozess zu vereinfachen, wurde ein Screening-Workflow zur schnellen Identifizierung der potenziellen Arzneimittelkombinationen, die das Wachstum von GSCs hemmen, aus chirurgischen Biopsien von Patienten-GBM entwickelt. Ein Sensitivitätsindex (SI), der die Differenz zwischen der erwarteten kombinierten Wirkung und der beobachteten kombinierten Wirkung widerspiegelt, wurde in diese Methode eingeführt, um die synergisierende Wirkung jedes Arzneimittels zu quantifizieren, so dass die potenziellen Kandidaten leicht durch das SI-Ranking identifiziert werden können. In der Zwischenzeit zeigt dieses Protokoll ein Beispiel-Screening, um die potenziellen Kandidaten zu identifizieren, die den Anti-Gliom-Effekt mit Temozolomid, der Erstlinien-Chemotherapie für die GBM-Behandlung, unter 20 kleinen molekularen Inhibitoren synergisieren können.

Protocol

Die GBM-Probe wurde von einem Patienten während einer Routineoperation erworben, nachdem die Ethikkommission für humane Forschung des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Nanjing Medical University die Zustimmung vollständig informiert erhalten hatte. 1. Isolierung und Kultur von patientenbasierten GSCs Legen Sie frisches chirurgisch reseziertes Glioblastomgewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist, und lagern Sie das Gewebe bis zur weiteren Op…

Representative Results

Die XG387-Zellen bildeten Neurosphären in dem in Tabelle 1 beschriebenen Kulturmedium in einer ultra-low attachment 6-Well-Kulturplatte oder einer nicht beschichteten Platte5 (Abbildung 1A). Zunächst wurde ein Test durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Biolumineszenzintensität von XG387-Luc-Zellen proportional zur Zellzahl war. Wie in Abbildung 1Bgezeigt, nahm die Biolumineszenzintensität proportional zur Zelldich…

Discussion

In der vorliegenden Studie wurde ein Protokoll beschrieben, das angewendet werden kann, um eine mögliche Kombinationstherapie für GBM mit patientenbasierten GSCs zu identifizieren. Im Gegensatz zum Standard-Synergie-/Additivitätsmetrikmodell wie Loewe-, BLISS- oder HSA-Methoden wurde ein einfacher und schneller Workflow verwendet, bei dem kein Arzneimittelpaar bei mehreren Konzentrationen in einer vollständig faktoriellen Weise wie bei den traditionellen Methoden kombiniert werden muss. In diesem Workflow wurde SI (S…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.