إدارة إيقاع القلب المتقدمة من خلال تطبيق التحفيز الضوئي متعدد المواقع البصري الوراثي في قلوب الفئران
Summary
يشير هذا العمل إلى طريقة للتحكم في إيقاع القلب لقلوب الفئران الفئران المعدلة وراثيا من القناة المعدلة وراثيا رودوبسين-2 (ChR2) باستخدام التحفيز الضوئي المحلي مع مصفوفة micro-LED ورسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات غشاء فوق القلب.
Abstract
يعد اضطراب نظم القلب البطيني سببا رئيسيا للوفيات والأمراض في جميع أنحاء العالم. إزالة الرجفان الكهربائي باستخدام الصدمات الكهربائية عالية الطاقة هو حاليا العلاج الوحيد للرجفان البطيني الذي يهدد الحياة. ومع ذلك ، قد يكون لإزالة الرجفان آثار جانبية ، بما في ذلك الألم الذي لا يطاق ، وتلف الأنسجة ، وتفاقم التشخيص ، مما يشير إلى وجود حاجة طبية كبيرة لتطوير استراتيجيات أكثر لطفا لإدارة ضربات القلب. إلى جانب النهج الكهربائية التي تقلل من الطاقة ، تم تقديم علم البصريات القلبية كأداة قوية للتأثير على نشاط القلب باستخدام قنوات أيون الغشاء الحساسة للضوء والنبضات الضوئية. في هذه الدراسة ، سيتم وصف طريقة قوية وصالحة للتحفيز الضوئي الناجح لقلوب الفئران السليمة في Langendorff استنادا إلى سرعة متعددة المواقع تطبق مجموعة 3 × 3 من الثنائيات الصغيرة الباعثة للضوء (micro-LED). يسمح رسم الخرائط البصرية المتزامنة لموجات الجهد الغشائي فوق القلبي بالتحقيق في آثار التحفيز الخاص بالمنطقة وتقييم نشاط القلب المستحث حديثا مباشرة في الموقع. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن فعالية إزالة الرجفان تعتمد بشدة على المعلمات المختارة للتحفيز الضوئي أثناء عدم انتظام ضربات القلب. سيتم إثبات أن المنطقة المضيئة من القلب تلعب دورا حاسما في نجاح الإنهاء وكذلك كيف يمكن تحقيق التحكم المستهدف في نشاط القلب أثناء الإضاءة لتعديل أنماط عدم انتظام ضربات القلب. باختصار ، توفر هذه التقنية إمكانية تحسين معالجة الآلية في الموقع على الطريق إلى التحكم في التغذية المرتدة في الوقت الفعلي لإيقاع القلب ، وفيما يتعلق بخصوصية المنطقة ، نهج جديدة في الحد من الضرر المحتمل لنظام القلب مقارنة باستخدام تطبيقات الصدمات الكهربائية غير المحددة.
Introduction
كشفت التحقيقات المبكرة للديناميكيات المكانية الزمانية أثناء عدم انتظام ضربات القلب أن الأنماط الكهربائية المعقدة أثناء الرجفان القلبي مدفوعة بموجات الإثارة الدوارة الشبيهة بالدوامة1. أعطت هذه النتيجة رؤى جديدة حول الآليات الأساسية لعدم انتظام ضربات القلب ، مما أدى بعد ذلك إلى تطوير علاجات إنهاء كهربائية جديدة تعتمد على الإثارة متعددة المواقع لعضلة القلب2،3،4. ومع ذلك ، فإن العلاجات التي تستخدم تحفيز المجال الكهربائي غير محلية وقد تعصب جميع الخلايا القابلة للإثارة المحيطة ، بما في ذلك الأنسجة العضلية ، مما يسبب تلفا للخلايا والأنسجة ، بالإضافة إلى ألم لا يطاق. وعلى النقيض من العلاجات الكهربائية، توفر الأساليب البصرية الجينية تقنية محددة وواقية للأنسجة لاستحضار إمكانات عمل الخلايا العضلية القلبية بدقة مكانية وزمنية عالية. لذلك ، فإن التحفيز البصري الوراثي لديه القدرة على التحكم في الحد الأدنى من التدخل الجراحي في أنماط التنشيط الفوضوية أثناء الرجفان القلبي.
إن إدخال قناة الأيونات الحساسة للضوء قناة رودوبسين-2 (ChR2) في الخلايا القابلة للإثارة عن طريق التلاعب الجيني5،6،7 ، مكن من إزالة الاستقطاب من إمكانات الغشاء للخلايا القابلة للإثارة باستخدام التحفيز الضوئي. تم تطوير العديد من التطبيقات الطبية ، بما في ذلك تنشيط الشبكات العصبية ، والتحكم في نشاط القلب ، واستعادة الرؤية والسمع ، وعلاج إصابات الحبل الشوكي ، وغيرهامن 8،9،10،11،12،13،14. تطبيق ChR2 في أمراض القلب لديه إمكانات كبيرة بسبب وقت الاستجابة بالمللي ثانية15 ، مما يجعله مناسبا تماما للتحكم المستهدف في ديناميكيات القلب غير المنتظمة.
في هذه الدراسة ، يظهر التحفيز الضوئي متعدد المواقع للقلوب السليمة لنموذج الفأر المعدل وراثيا. وبإيجاز، أنشئ خط فأر ألفا – MHC-ChR2 معدل وراثيا في نطاق البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) وتفضلت بتقديمه البروفيسور س. إ. لينارت. بشكل عام ، تم إقران الذكور البالغين المعدلة وراثيا C57 / B6 / J ، التي تعبر عن Cre-recombinase تحت سيطرة alpha-MHC للتزاوج مع الإناث B6.Cg-GT (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J. منذ حذف كاسيت STOP القلبي في الجيل الثاني ، أظهر النسل تعبيرا مستقرا MHC-ChR2 وتم استخدامه للحفاظ على مستعمرات القلب الحساسة للضوء. أجريت جميع التجارب على الفئران البالغة من كلا الجنسين في سن 36 – 48 أسبوعا. يتم تحقيق الإضاءة باستخدام صفيف 3 × 3 micro-LED ، تم تصنيعه كما هو موضح في16,17 باستثناء عدم تنفيذ السكن القائم على السيليكون والألياف الزجاجية البصرية القصيرة. تم العثور على أول استخدام له في تطبيق القلب في18. تم تطبيق مصفوفة micro-LED خطية تعتمد على تقنية تصنيع مماثلة كمسبار اختراق لسرعة القلب19. يتم ترتيب مصابيح LED الدقيقة في صفيف 3 × 3 على درجة 550 ميكرومتر ، مما يوفر دقة مكانية عالية وقوة إشعاع عالية على مساحة صغيرة جدا. يوضح المؤلفون في هذا العمل تحجيما ضوئيا محليا متعدد الاستخدامات متعدد المواقع قد يفتح الطريق لتطوير طرق علاج جديدة مضادة لعدم انتظام ضربات القلب.
يتضمن البروتوكول التجريبي التالي تروية Langendorff الرجعية خارج الجسم الحي ، والتي يعمل فيها الشريان الأورطي المعلب كمدخل تروية. بسبب ضغط التروية المطبق وتقلص القلب ، يتدفق البيرفوسات عبر الشرايين التاجية ، التي تتفرع من الشريان الأورطي. في العمل المقدم ، يتم تشغيل القلب باستخدام إعداد ضغط ثابت يتم تحقيقه عن طريق رفع خزانات البيرفوسات إلى ارتفاع 1 متر ، أي ما يعادل 73.2 مم زئبق ، مما يؤدي إلى معدل تدفق يبلغ 2.633 ± 0.583 مل / دقيقة. يتم استخدام نوعين من محلول Tyrode كعطور أثناء التجربة. يدعم محلول Tyrode العادي إيقاع الجيوب الأنفية المستقر ، في حين يتم خلط محلول Low-K + Tyrode مع Pinacidil لتمكين تحريض عدم انتظام ضربات القلب في قلوب الفئران. يسمح استخدام حمام مائي سداسي الأضلاع بمراقبة القلب من خلال ست نوافذ مستوية مختلفة ، مما يسمح باقتران العديد من المكونات البصرية مع تشوه أقل عن طريق الانكسار.
Protocol
Representative Results
Discussion
العلاج الناجح لاضطرابات نظم القلب هو مفتاح علاج القلب. ومع ذلك ، فإن الآليات الفيزيائية الحيوية الكامنة وراء بدء عدم انتظام ضربات القلب واستمراره وإنهائه ليست مفهومة تماما. لذلك ، تهدف أبحاث القلب إلى تحسين العلاج بالصدمة الكهربائية نحو إنهاء أكثر لطفا لعدم انتظام ضربات القلب ، وبالتالي …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا ماريون كونزي وتينا ألتهاوس على دعمهم الفني الممتاز أثناء التجارب. وقد تلقى البحث الذي أدى إلى النتائج تمويلا من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241526. كما تم تقديم الدعم من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، DZHK e.V. (المشروع MD28)، والموقع الشريك Goettingen، ومؤسسة الأبحاث الألمانية CRC 1002 (المشروع C03)، وجمعية ماكس بلانك. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل BrainLinks-BrainTools ، مجموعة التميز التي تمولها مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG ، رقم المنحة EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Referenzen
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
