ניהול מתקדם של קצב הלב על ידי יישום פוטו-גירוי אופטוגנטי מרובה אתרים בלבבות מורין
Summary
עבודה זו מדווחת על שיטה לשליטה בקצב הלב של לבבות מורין שלמים של עכברי channelrhodopsin-2 מהונדסים (ChR2) באמצעות פוטוסטימולציה מקומית עם מערך מיקרו-LED ומיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל קרום הלב.
Abstract
טכיאריתמיות חדריות הן גורם מרכזי לתמותה ולתחלואה ברחבי העולם. דפיברילציה חשמלית באמצעות שוקים חשמליים באנרגיה גבוהה היא כיום הטיפול היחיד בפרפור חדרים מסכן חיים. עם זאת, לדפיברילציה עלולות להיות תופעות לוואי, כולל כאבים בלתי נסבלים, נזק לרקמות והחמרה בפרוגנוזה, מה שמעיד על צורך רפואי משמעותי בפיתוח אסטרטגיות עדינות יותר לניהול קצב הלב. מלבד גישות חשמליות מפחיתות אנרגיה, אופטוגנטיקה לבבית הוצגה ככלי רב עוצמה להשפעה על פעילות הלב באמצעות תעלות יונים רגישות לאור ופולסים של אור. במחקר הנוכחי תתואר שיטה חזקה ותקפה לפוטוסימולציה מוצלחת של לבבות מורין שלמים של לנגנדורף על בסיס קצב רב-אתרים המפעיל מערך של 3 x 3 של דיודות פולטות אור מיקרו (micro-LED). מיפוי אופטי סימולטני של גלי מתח ממברנה אפיקרדיאלית מאפשר לחקור את ההשפעות של גירוי ספציפי לאזור ומעריך את הפעילות הלבבית החדשה שנוצרה ישירות באתר. התוצאות המתקבלות מראות כי היעילות של דפיברילציה תלויה מאוד בפרמטרים שנבחרו עבור פוטוסטימולציה במהלך הפרעת קצב לב. יודגם כי האזור המואר של הלב ממלא תפקיד מכריע להצלחת ההפסקה, כמו גם כיצד ניתן להשיג שליטה ממוקדת בפעילות הלב במהלך ההארה לשינוי דפוסי הפרעות קצב. לסיכום, טכניקה זו מספקת אפשרות לייעל את מניפולציית המנגנון באתר בדרך לבקרת משוב בזמן אמת של קצב הלב, ובנוגע לספציפיות האזור, גישות חדשות בהפחתת הנזק הפוטנציאלי למערכת הלב בהשוואה לשימוש ביישומי הלם חשמלי לא ספציפיים.
Introduction
חקירות מוקדמות של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית במהלך הפרעות קצב גילו כי הדפוסים החשמליים המורכבים במהלך פרפור הלב מונעים על ידי גלי עירור מסתובבים דמויי מערבולת1. ממצא זה נתן תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של הפרעות קצב, מה שהוביל לאחר מכן לפיתוח טיפולים חדשניים לסיום חשמלי המבוססים על עירור רב-אתרים של שריר הלב 2,3,4. עם זאת, טיפולים באמצעות גירוי שדה חשמלי אינם מקומיים ועלולים להחדיר את כל התאים המעוררים שמסביב, כולל רקמת שריר, ולגרום נזק לתאים ולרקמות, כמו גם לכאב בלתי נסבל. בניגוד לטיפולים חשמליים, גישות אופטוגנטיות מספקות טכניקה ספציפית ומגינה על רקמות לעידוד פוטנציאל פעולה קרדיומיוציטים בדיוק מרחבי וזמני גבוה. לכן, לגירוי אופטוגנטי יש פוטנציאל לשליטה זעיר פולשנית בדפוסי ההפעלה הכאוטיים במהלך פרפור הלב.
הכנסת תעלת היונים הרגישה לאור channelrhodopsin-2 (ChR2) לתאים מעוררים באמצעות מניפולציה גנטית 5,6,7, אפשרה דה-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה של תאים מעוררים באמצעות פוטוסטימולציה. מספר יישומים רפואיים, כולל הפעלת רשתות נוירונים, שליטה על פעילות הלב, שחזור ראייה ושמיעה, טיפול בפגיעות בחוט השדרה ואחריםפותחו 8,9,10,11,12,13,14. היישום של ChR2 בקרדיולוגיה הוא בעל פוטנציאל משמעותי בשל זמן התגובה של אלפית השנייה15, מה שהופך אותו מתאים היטב לבקרה ממוקדת של דינמיקה לבבית קצבית.
במחקר זה מוצגת פוטוסטימולציה מרובת אתרים של לבבות שלמים של מודל עכבר מהונדס. לסיכום, קו עכברי אלפא-MHC-ChR2 מהונדסים הוקם במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) וסופק בחביבות על ידי פרופ ‘ס. א. לנארט. באופן כללי, זכר בוגר מהונדס C57/B6/J, המבטא Cre-recombinase תחת שליטה של אלפא-MHC היו מזווגים להזדווג עם נקבה B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. מכיוון שקלטת ה-STOP של הלב נמחקה בדור השני, הצאצאים הראו ביטוי MHC-ChR2 יציב ושימשו לשמירה על מושבות רגישות לב. כל הניסויים נעשו עם עכברים בוגרים משני המינים בגיל 36 – 48 שבועות. התאורה מושגת באמצעות מערך מיקרו-LED בגודל 3 x 3, המיוצר כמתוארב-16,17, אלא שהמארז המבוסס על סיליקון וסיבי הזכוכית האופטיים הקצרים אינם מיושמים. השימוש הראשון שלה ביישום לב נמצא ב18. מערך מיקרו-LED ליניארי המבוסס על טכנולוגיית ייצור דומה יושם כגשושית חודרת לקצב לב19. נוריות המיקרו-נוריות מסודרות במערך של 3 על 3 במגרש של 550 מיקרומטר, ומספקות הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן הספק קורן גבוה על שטח קטן מאוד. המחברים מדגימים בעבודה זו פוטוסטימולציה מקומית רב-תכליתית מרובת אתרים שעשויה לפתוח את הדרך לפיתוח שיטות טיפול חדשניות נגד הפרעות קצב.
הפרוטוקול הניסיוני הבא כולל פרפוזיה מדרדרת של Langendorff ex vivo, שעבורה אבי העורקים המשומר מתפקד ככניסת פרפוזיה. בשל לחץ הזלוף המופעל והתכווצות הלב המבושם זורם דרך העורקים הכליליים, המסתעפים מאבי העורקים. בעבודה המוצגת, הלב הוא perfused באמצעות מערך לחץ קבוע שהושג על ידי העלאת מאגרי perfusate לגובה 1 מ ‘, שווה ערך 73.2 מ”מ כספית, אשר מניב לקצב זרימה של 2.633 ± 0.583 מ”ל / דקה. שני סוגים של תמיסה של טירודה משמשים כמטען במהלך הניסוי. התמיסה של טירודה רגילה תומכת בקצב סינוסים יציב, בעוד שהפתרון של Low-K+ Tyrode מעורבב עם Pinacidil כדי לאפשר השראה של הפרעות קצב בלבבות מורין. השימוש באמבט מים משושה מאפשר תצפית על הלב דרך שישה חלונות מישוריים שונים, ומאפשר צימוד של מספר רכיבים אופטיים עם פחות עיוות על ידי שבירה.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול מוצלח של tachyarrhythmias לב הוא המפתח לטיפול לב. עם זאת, המנגנונים הביופיזיקליים העומדים בבסיס התחלת הפרעות קצב, הנצחה וסיום אינם מובנים במלואם. לכן, מחקר לב שואף לייעל את הטיפול בהלם חשמלי לקראת סיום עדין יותר של הפרעות קצב, ובכך להגדיל את איכות החיים של המטופלים 28,29,30,31.<su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למריון קונזה וטינה אלטהאוס על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם במהלך הניסויים. המחקר שהוביל לתוצאות קיבל מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 במסגרת הסכם מענק מספר HEALTH-F2-2009-241526. התמיכה ניתנה גם על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם, DZHK e.V. (פרויקט MD28), האתר השותף Goettingen, קרן המחקר הגרמנית CRC 1002 (פרויקט C03), ואגודת מקס פלנק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי BrainLinks-BrainTools, אשכול מצוינות במימון קרן המחקר הגרמנית (DFG, מענק מספר EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Referenzen
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
