Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie
Summary
Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.
Abstract
Een onlangs gepubliceerd DNA-extractieprotocol met behulp van magnetische kralen en een geautomatiseerd DNA-extractie-instrument suggereerde dat het mogelijk is om DNA van hoge kwaliteit en kwantiteit te extraheren uit een goed bewaarde individuele mug die voldoende is voor downstream hele genoomsequencing. Vertrouwen op een duur geautomatiseerd DNA-extractie-instrument kan echter voor veel laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier biedt de studie een budgetvriendelijk dna-extractieprotocol op basis van magnetische kraal, dat geschikt is voor lage tot gemiddelde doorvoer. Het hier beschreven protocol is met succes getest met behulp van individuele Aedes aegypti muggenmonsters. De lagere kosten in verband met dna-extractie van hoge kwaliteit zullen de toepassing van hoge doorvoer sequencing op resource beperkte laboratoria en studies verhogen.
Introduction
Recente ontwikkeling van een verbeterd DNA-extractieprotocol1 heeft veel downstreamstudies met een hoge impact mogelijk gemaakt met hele genoomsequencing2,3,4,5,6. Dit magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen biedt een betrouwbare DNA-opbrengst van individuele muggenmonsters, wat op zijn beurt de kosten en tijd vermindert die gepaard gaan met het verkrijgen van een voldoende aantal monsters uit veldcollecties.
Recente vooruitgang in populatie- en landschapsgenomica is direct gecorreleerd met dalende kosten van hele genoomsequencing. Hoewel het vorige DNA-extractieprotocol1 de efficiëntie verhoogt die gepaard gaat met sequencing met hoge doorvoer, kunnen kleinere laboratoria / studies zonder de fondsen zich afmelden voor het gebruik van deze nieuwe krachtige landschaps- en populatiegenomicatools vanwege de kosten van de implementatie van het protocol (bijv. kosten van gespecialiseerde instrumenten).
Hier wordt een aangepast DNA-extractieprotocol gepresenteerd dat een vergelijkbare magnetische kraalextractiestap gebruikt als Neiman et al.1 om DNA met een hoge zuiverheid te verkrijgen, maar niet afhankelijk is van dure instrumenten voor weefsellysis en DNA-extractie. Dit protocol is geschikt voor experimenten waarbij >10 ng hoogwaardig DNA nodig is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor andere insectensoorten. De oorspronkelijke versie van het protocol geïntroduceerd in Nieman et al.1 is getest op meerdere soorten, waaronder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de financiering van het Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, gefinancierd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC-subsidie NU50CK000420-04-04, het USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) De bevindingen en conclusies in dit artikel zijn die van de auteur(s) en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referenzen
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
