In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato
Summary
Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.
Abstract
As plaquetas são produzidas por megacaiócitos, células especializadas localizadas na medula óssea. A possibilidade de imagem de megacaiócitos em tempo real e seu ambiente nativo foi descrita há mais de 10 anos e lança uma nova luz sobre o processo de formação de plaquetas. Os megacariócitos estendem as saliências alongadas, chamadas proplatelets, através do revestimento endotelial dos vasos sinusoides. Este artigo apresenta um protocolo para imagem simultânea em tempo real fluorescentemente rotulado megacariócitos na medula óssea do crânio e vasos sinusoides. Esta técnica conta com uma pequena cirurgia que mantém o crânio intacto para limitar as reações inflamatórias. A cabeça do rato é imobilizada com um anel colado no crânio para evitar que os movimentos respirem.
Usando microscopia de dois fótons, megacariócitos podem ser visualizados por até algumas horas, permitindo a observação de saliências celulares e proplatelets no processo de alongamento dentro de vasos sinusoides. Isso permite a quantificação de vários parâmetros relacionados à morfologia das protrusões (largura, comprimento, presença de áreas de constrição) e seu comportamento de alongamento (velocidade, regularidade ou presença de pausas ou fases de retração). Esta técnica também permite o registro simultâneo de plaquetas circulantes em vasos sinusoides para determinar a velocidade plaqueta e a direção do fluxo sanguíneo. Este método é particularmente útil para estudar o papel dos genes de interesse na formação de plaquetas usando camundongos geneticamente modificados e também é favorável aos testes farmacológicos (estudar os mecanismos, avaliando drogas no tratamento de distúrbios de produção de plaquetas). Tornou-se uma ferramenta inestimável, especialmente para complementar estudos in vitro, pois agora se sabe que a formação in vivo e in vitro proplatelet depende de diferentes mecanismos. Foi demonstrado, por exemplo, que microtúbulos in vitro são necessários para alongamento proplatelet por si só. No entanto, in vivo, eles preferem servir como um andaime, o alongamento sendo promovido principalmente por forças de fluxo sanguíneo.
Introduction
As plaquetas são produzidas por células especializadas em megacaiócitos localizadas na medula óssea. A maneira precisa como os megacaiócitos liberam plaquetas na circulação há muito tempo não ficou clara devido ao desafio técnico em observar eventos em tempo real através do osso. A microscopia de dois fótons ajudou a superar esse desafio e levou a grandes avanços na compreensão do processo de formação de plaquetas. As primeiras observações in vivo de megacaito foram feitas por von Andrian e colegas em 2007, com a visualização de megacaiócitos fluorescentes através do crânio1. Isso foi possível porque a camada óssea no crânio frontoparietal de camundongos adultos jovens tem uma espessura de algumas dezenas de mícrons e é suficientemente transparente para permitir a visualização de células fluorescentes na medula óssea subjacente2.
Estudos subsequentes aplicaram este procedimento para avaliar a formação de proplatos em várias condições e decifrar os mecanismos subjacentes3,4,5,6. Esses estudos forneceram evidências definitivas de que os megacaiócitos ampliam dinamicamente as saliências, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial dos vasos sinusoides(Figura 1). Essas propuladas são então liberadas como fragmentos longos que representam várias centenas de plaquetas em volume. As plaquetas serão formadas após a remodelação das propuladas na microcirculação de órgãos a jusante, notadamente nos pulmões7. Até o momento, no entanto, o processo preciso e os mecanismos moleculares permanecem sujeitos a debate. Por exemplo, o papel proposto das proteínas citoesqueletal no alongamento das proplatelets difere entre as condições in vitro e in vivo 3, e as diferenças na formação de proplatelets têm sido demonstradas sob condições inflamatórias6. Complicando ainda mais as coisas, um estudo recente contestou o conceito orientado por proplatelet e propôs que in vivo, plaquetas são essencialmente formadas através de um mecanismo de brotação de membrana no megacaiócito nível8.
Este artigo apresenta um protocolo para a observação de megacaiócitos e proplatelets na medula óssea do osso do crânio em camundongos vivos, usando um procedimento minimamente invasivo. Abordagens semelhantes foram descritas anteriormente para visualizar outras células de medula, notadamente células hematopoiéticas e progenitoras9. O foco aqui está na observação de megacaiócitos e plaquetas para detalhar alguns parâmetros que podem ser medidos, notadamente morfologias proplatelet e velocidade plaqueta. Este protocolo apresenta como inserir um cateter na veia jugular para injetar traços fluorescentes e drogas e observar através do osso do crânio. O osso calvário é exposto usando uma pequena cirurgia para que um anel seja colado ao osso. Este anel serve para imobilizar a cabeça e evitar movimentos devido à respiração e formar um copo cheio de soro fisiológico como o meio de imersão da lente. Esta técnica é bem adequada para i) observar em tempo real a geometria sinusoide e megacariócitos interagindo com a parede do vaso; ii) seguir os megacaitos no processo de formação de proplatelet, alongamento e liberação; e iii) medir os movimentos das plaquetas para monitorar o complexo fluxo sanguíneo sinusoide. Os dados obtidos usando este protocolo foram publicados recentemente3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os mecanismos de formação de plaquetas são altamente dependentes do ambiente de medula óssea. Assim, a microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante no campo para visualizar o processo em tempo real. Camundongos com megacaiócitos fluorescentes podem ser obtidos cruzando camundongos expressando a recombinase cre em megacaiócitos com qualquer rato repórter floxed contendo um de expressão genética fluorescente condicional. Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciência e Tecnologia da Áustria, Klosterneuburg, Áustria) por seu conselho de especialistas em experimentos de microscopia de dois fótons na época em que estabelecemos a técnica no laboratório, e Yves Lutz no Centro de Imagens IGBMC /CBI (Illkirch, França) por sua experiência e ajuda com o microscópio de dois fótons. Agradecemos também a Jean-Yves Rinkel por sua ajuda técnica e Inês Guinard pelo desenho do esquema na Figura 1. Agradecemos à ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pelo apoio na aquisição do microscópio de dois fótons. A AB foi apoiada por bolsas de pós-doutorado da Etablissement Français du Sang (APR2016) e da Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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