In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón
Summary
Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.
Abstract
Las plaquetas son producidas por megacariocitos, células especializadas ubicadas en la médula ósea. La posibilidad de obtener imágenes de megacariocitos en tiempo real y su entorno nativo se describió hace más de 10 años y arroja nueva luz sobre el proceso de formación de plaquetas. Los megacariocitos extienden protuberancias alargadas, llamadas proplatletas, a través del revestimiento endotelial de los vasos sinusoides. Este artículo presenta un protocolo para obtener imágenes simultáneas en tiempo real de megacariocitos etiquetados fluorescentemente en la médula ósea del cráneo y los vasos sinusoides. Esta técnica se basa en una cirugía menor que mantiene el cráneo intacto para limitar las reacciones inflamatorias. La cabeza del ratón se inmoviliza con un anillo pegado al cráneo para evitar que los movimientos respiren.
Utilizando microscopía de dos fotones, los megacariocitos se pueden visualizar hasta por unas pocas horas, lo que permite la observación de protuberancias celulares y proplatlets en el proceso de elongación dentro de los vasos sinusoides. Esto permite cuantificar varios parámetros relacionados con la morfología de las protuberancias (anchura, longitud, presencia de zonas de constricción) y su comportamiento de elongación (velocidad, regularidad, o presencia de pausas o fases de retracción). Esta técnica también permite el registro simultáneo de plaquetas circulantes en los vasos sinusoides para determinar la velocidad plaquetaria y la dirección del flujo sanguíneo. Este método es particularmente útil para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas utilizando ratones modificados genéticamente y también es susceptible de pruebas farmacológicas (estudiar los mecanismos, evaluar medicamentos en el tratamiento de trastornos de producción de plaquetas). Se ha convertido en una herramienta invaluable, especialmente para complementar los estudios in vitro, ya que ahora se sabe que la formación de proplatlet in vivo e in vitro se basa en diferentes mecanismos. Se ha demostrado, por ejemplo, que los microtúbulos in vitro son necesarios para el alargamiento proplalet per se. Sin embargo, in vivo,más bien sirven como un andamio, el alargamiento es promovido principalmente por las fuerzas del flujo sanguíneo.
Introduction
Las plaquetas son producidas por células especializadas en megacariocitos ubicadas en la médula ósea. La forma precisa en que los megacariocitos liberan plaquetas en la circulación ha permanecido poco clara durante mucho tiempo debido al desafío técnico en la observación de eventos en tiempo real a través del hueso. La microscopía de dos fotones ha ayudado a superar este desafío y ha llevado a grandes avances en la comprensión del proceso de formación de plaquetas. Las primeras observaciones in vivo de megacariocitos fueron realizadas por von Andrian y sus colegas en 2007, con la visualización de megacariocitos fluorescentes a través del cráneo1. Esto fue posible porque la capa ósea en el cráneo frontoparietal de ratones adultos jóvenes tiene un grosor de unas pocas decenas de micras y es lo suficientemente transparente como para permitir la visualización de células fluorescentes en la médula ósea subyacente2.
Los estudios posteriores aplicaron este procedimiento para evaluar la formación de proplatlets en diversas condiciones y para descifrar los mecanismos subyacentes3,4,5,6. Estos estudios proporcionaron evidencia definitiva de que los megacariocitos extienden dinámicamente las protuberancias, llamadas proplatlets, a través de la barrera endotelial de los vasos sinusoides(Figura 1). Estos proplatlets se liberan como fragmentos largos que representan varios cientos de plaquetas en volumen. Las plaquetas se formarán después de la remodelación de los proplatlets en la microcirculación de los órganos aguas abajo, especialmente en los pulmones7. Hasta la fecha, sin embargo, el proceso preciso y los mecanismos moleculares siguen siendo objeto de debate. Por ejemplo, el papel propuesto de las proteínas citoesqueléticas en el alargamiento de los proplatlets difiere entre las condiciones in vitro e in vivo 3, y las diferencias en la formación de proplatlet se han demostrado en condiciones inflamatorias6. Para complicar aún más las cosas, un estudio reciente cuestionó el concepto impulsado por proplatelets y propuso que in vivo,las plaquetas se forman esencialmente a través de un mecanismo de gemación de membrana en el nivel de megacariocitos8.
Este trabajo presenta un protocolo para la observación de megacariocitos y proplatlets en la médula ósea a partir del hueso del cráneo en ratones vivos, utilizando un procedimiento mínimamente invasivo. Se han descrito enfoques similares para visualizar otras células de la médula, en particular las células madre y progenitoras hematopoyéticas9. El enfoque aquí está en la observación de megacariocitos y plaquetas para detallar algunos parámetros que se pueden medir, en particular las morfologías propallet y la velocidad plaquetaria. Este protocolo presenta cómo insertar un catéter en la vena yugular para inyectar trazadores fluorescentes y medicamentos y observar a través del hueso del cráneo. El hueso calvarial se expone mediante cirugía menor para que se pegue un anillo al hueso. Este anillo sirve para inmovilizar la cabeza y evitar movimientos debidos a la respiración y formar una copa llena de solución salina como medio de inmersión de la lente. Esta técnica es muy adecuada para i) observar en tiempo real la geometría sinusoide y los megacariocitos interactuando con la pared del vaso; ii) seguir a los megacariocitos en el proceso de formación, elongación y liberación de proplatlet; y iii) medir los movimientos plaquetarios para monitorear el flujo sanguíneo sinusoide complejo. Los datos obtenidos mediante este protocolo han sido publicados recientemente3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los mecanismos de formación de plaquetas son altamente dependientes del entorno de la médula ósea. Por lo tanto, la microscopía intravital se ha convertido en una herramienta importante en el campo para visualizar el proceso en tiempo real. Los ratones con megacariocitos fluorescentes se pueden obtener cruzando ratones que expresan la cre recombinasa en megacariocitos con cualquier ratón reportero floxed que contenga un casete de expresión génica fluorescente condicional. Aquí, se utilizaron ratones reporteros mT…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria) por su asesoramiento experto sobre experimentos de microscopía de dos fotones en el momento en que establecimos la técnica en el laboratorio, e Yves Lutz en el Centro de Imágenes IGBMC / CBI (Illkirch, Francia) por su experiencia y ayuda con el microscopio de dos fotones. También agradecemos a Jean-Yves Rinkel por su ayuda técnica e Ines Guinard por el dibujo del esquema en la Figura 1. Agradecemos a ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) su apoyo en la adquisición del microscopio de dos fotones. AB fue apoyado por becas postdoctorales de Etablissement Français du Sang (APR2016) y de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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