تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل
Summary
هنا نقدم بروتوكولا لتحديد سريع للبروتينات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض تسلسل الجينوم باستخدام MALDI-TOF-TOF قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل مع البرامج التي وضعت في المنزل. أيونات البروتين ميتاستابل جزء بسبب تأثير حمض الأسبارتيك ويتم استغلال هذه خصوصية لتحديد البروتين.
Abstract
يحدد هذا البروتوكول بروتينات المناعة للإنزيمات المبيدة للبكتيريا: colicin E3 والبكتيريا ، التي تنتجها سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض باستخدام تحريض المضادات الحيوية ، وتم تحديدها من قبل قياس الطيف الكتلي المترادف MALDI-TOF والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل مع البرامج المطورة داخليا. تم تحديد بروتين المناعة من الكوليسين E3 (Im3) وبروتين المناعة من البكتيريا (Im-Bac) من أيونات جزء بارزة من نوع b و / أو y التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام العمود الفقري للبوليبتيد (PBC) على الجانب C-terminal من حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك ومخلفات الهليون بواسطة آلية تجزئة تأثير حمض الأسبارتيك. البرنامج بمسح بسرعة في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم كله من سلالة بكتيرية. البرنامج أيضا يزيل تكراريا بقايا الأحماض الأمينية من تسلسل البروتين في حالة أن يتم اقتطاع تسلسل البروتين ناضجة. يمتلك تسلسل بروتين واحد أيونات الكتلة والشظايا بما يتفق مع تلك التي تم اكتشافها لكل بروتين مناعة. ثم تم فحص تسلسل المرشح يدويا للتأكد من إمكانية تعيين جميع أيونات الأجزاء المكتشفة. تمت إزالة ميثيونين N-terminal من Im3 بعد الترجمة ، في حين كان Im-Bac التسلسل الكامل. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن اثنين أو ثلاثة فقط من أيونات الشظايا غير التكميلية التي شكلتها لجنة البرنامج والميزانية ضرورية لتحديد تسلسل البروتين الصحيح. وأخيرا، تم تحديد مروج (صندوق SOS) في المنبع لجينات مضادة للبكتيريا والمناعة في جينوم بلازميد للسلالة البكتيرية.
Introduction
يشار إلى تحليل وتحديد البروتينات غير المهضومة عن طريق قياس الطيف الكتلي على أنه التحليل البروتيوميكي من أعلى إلى أسفل1،2،3،4. وهي الآن تقنية راسخة تستخدم تأين الرذاذ الكهربائي (ESI)5 وتحليلات الكتلة عالية الدقة6، وتقنيات التفكك المتطورة ، على سبيل المثال ، فصاب نقل الإلكترون (ETD) ، فصيل التقاط الإلكترون (ECD)7، الفصام فوق البنفسجي للصور (UV-PD)8، إلخ.
تقنية التأين الناعمة الأخرى هي desorption الليزر بمساعدة المصفوفة / التأين (MALDI)9،10،11 التي تم استخدامها على نطاق أقل على نطاق واسع للتحليل من أعلى إلى أسفل ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها تقترن في المقام الأول إلى وقت الطيران (TOF) محللات الكتلة ، والتي لديها دقة محدودة مقارنة مع محللات الكتلة الأخرى. وعلى الرغم من هذه القيود، استغلت أدوات MALDI-TOF وMALDI-TOF-TOF للتحليل السريع من أعلى إلى أسفل للبروتينات النقية والخليط المجزئ وغير المكسر من البروتينات. لتحديد البروتينات النقية، الاضمحلال في المصدر (ISD) هو تقنية مفيدة بشكل خاص لأنه يسمح تحليل الطيف الكتلي (MS) من أيونات شظايا ISD، فضلا عن الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (MS/ MS) من شظايا أيون البروتين توفير جزء تسلسل محدد في كثير من الأحيان من N- و C-termini من البروتين المستهدف، على غرار تسلسل إدمان12،13 . العيب في نهج ISD هو أنه ، كما هو الحال في تسلسل إدمان ، يجب أن تحتوي العينة على بروتين واحد فقط. ويعزى شرط البروتين الوحيد إلى الحاجة إلى إسناد أيونات الشظايا بشكل لا لبس فيه إلى أيونات السلائف. إذا كان هناك اثنين أو أكثر من البروتينات الموجودة في عينة، قد يكون من الصعب تعيين أي أيونات الشظايا تنتمي إلى أي أيونات السلائف.
ويمكن معالجة إسناد أيونات الشظايا/السلائف باستخدام الملدي -TOF-TOF-MS/MS. وكما هو الحال مع أي تجربة كلاسيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد/ مرض التصلب العصبي المتعدد، فإن أيونات السلائف يتم اختيارها/عزلها على نطاق واسع قبل التفتت، ويمكن أن تعزى أيونات الشظايا المكتشفة إلى أيون سلائف محدد. ومع ذلك ، تقتصر تقنيات الانفصال المتاحة لهذا النهج على التفكك الناجم عن تصادم الطاقة العالية في المقام الأول (HE-CID)14 أو الاضمحلال بعد المصدر (PSD)15،16. HE-CID و PSD هي الأكثر فعالية في تجزئة الببتيدات والبروتينات الصغيرة، ويمكن أن تكون تغطية التسلسل، في بعض الحالات، محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي PSD في شق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC) في المقام الأول على الجانب C-المحطة من بقايا حمض الأسبارتيك والغلوتاميك من قبل ظاهرة تسمى تأثير حمض الأسبارتيك17،18،19،20.
وقد وجدت مالدي-TOF-MS أيضا تطبيق متخصصة في تحديد التصنيف من الكائنات الحية الدقيقة: البكتيريا21، الفطريات22، والفيروسات23. على سبيل المثال، تستخدم أطياف التصلب المتعدد لتحديد البكتيريا غير المعروفة بالمقارنة مع مكتبة مرجعية لأطياف MS للبكتيريا المعروفة باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط للمقارنة. وقد أثبت هذا النهج نجاحا كبيرا بسبب سرعته وبساطته، على الرغم من أنه يتطلب زراعة العزل بين عشية وضحاها. أيونات البروتين التي تم الكشف عنها من خلال هذا النهج (عادة تحت 20 كيلودا) تشمل بصمة MS السماح القرار التصنيفي على مستوى جنس والأنواع وفي بعض الحالات في الأنواع الفرعية24 وسلالة مستوى25،26. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة ليس فقط لتصنيف الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض بشكل تصنيفي فحسب، بل أيضا تحديد عوامل خبيثة محددة، والسموم، وعوامل مقاومة مضادات الميكروبات (AMR). ولتحقيق ذلك، يتم قياس كتلة الببتيدات أو البروتينات أو الجزيئات الصغيرة بالتصلب المتعدد ثم عزلها وتجزئتها بواسطة MS/MS.
البكتيريا المسببة للأمراض غالبا ما تحمل قطع دائرية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميدات، جنبا إلى جنب مع البروبهاج، هي ناقل رئيسي لنقل الجينات الأفقية بين البكتيريا وهي مسؤولة عن الانتشار السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وغيرها من عوامل الفوعة عبر البكتيريا. قد تحمل البلازميدات أيضا جينات مضادة للبكتيريا (AB) ، على سبيل المثال ، كوليسين وبكتيريا. عندما يتم التعبير عن هذه الجينات وإفراز البروتينات ، فإنها تعمل على تعطيل آلات ترجمة البروتين من البكتيريا المجاورة التي تحتل نفس المكانة البيئية27. ومع ذلك ، يمكن أن تشكل هذه الإنزيمات المبيدة للبكتيريا خطرا على المضيف الذي أنتجها. ونتيجة لذلك ، يتم التعبير عن الجين من قبل المضيف الذي يمنع على وجه التحديد وظيفة إنزيم AB ويشار إليه باسم بروتين المناعة (Im).
وغالبا ما تستخدم المضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي مثل mitomycin-C و ciprofloxacin للحث على استجابة SOS في الإشريكية القولونية المنتجة للسموم في شيغا (STEC) التي يوجد جين سم شيغا(stx) داخل جينوم البروجاب الموجود في الجينوم البكتيري28. لقد استخدمنا التعريفي المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل سابقا للكشف عن وتحديد أنواع Stx والأنواع الفرعية التي تنتجها سلالات STEC29،30،31،32. في العمل السابق، STEC O113:H21 سلالة RM7788 كان مثقف بين عشية وضحاها على وسائل الإعلام أجار تكملها mitomycin-C. ومع ذلك ، بدلا من الكشف عن المتوقع B – subunit من Stx2a في م / ض ~7816 ، تم الكشف عن أيون بروتين مختلف في م / ض ~ 7839 وحددت على أنها بروتين افتراضي بلازميد المشفرة من وظيفة غيرمعروفة 33. في العمل الحالي، حددنا اثنين من البروتينات AB-Im المشفرة بلازميد التي تنتجها هذه السلالة باستخدام تحريض المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل باستخدام برامج مستقلة وضعت لمعالجة ومسح في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم الكامل (WGS). وبالإضافة إلى ذلك، أدرجت إمكانية إدخال تعديلات بعد الترجمة تتضمن اقتطاع التسلسل في البرنامج الحاسوبي. تم تحديد بروتينات المناعة باستخدام هذا البرنامج من الكتلة المقاسة من أيون البروتين الناضج أيونات جزء تسلسل محدد من لجنة البرنامج والميزانية الناجمة عن تأثير حمض الأسبارتيك والكشف عنها من قبل MS / MS-PSD. وأخيرا، تم تحديد مروج المنبع من الجينات AB / ايم في الجينوم البلازميد التي قد تفسر التعبير عن هذه الجينات عندما تتعرض هذه السلالة لمضاد حيوي ضار بالحمض النووي. تم تقديم أجزاء من هذا العمل في الاجتماع الافتراضي للجمعية الكيميائية الأمريكية الوطنية خريف 2020 والمعرض (17-20 أغسطس 2020)34.
Protocol
Representative Results
Discussion
اعتبارات البروتوكول
وتتمثل نقاط القوة الرئيسية للبروتوكول الحالي في سرعته وبساطة إعداد العينات واستخدام أداة يسهل تشغيلها نسبيا والتدريب عليها وصيانتها. على الرغم من أن التحليل البروتيوميكي من أسفل إلى أعلى ومن أعلى إلى أسفل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة-ESI-HR-MS موجود في كل م…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البروتين Biomarker الباحث البرمجيات متاحة بحرية (دون أي تكلفة) عن طريق الاتصال كليفتون ك. Fagerquist في clifton.fagerquist@usda.gov. نود أن نعترف بدعم هذا البحث من قبل ARS، وزارة الزراعة الأميركية، منحة CRIS: 2030-42000-051-00-D.
Materials
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
Referenzen
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
- He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
- Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
- Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
- Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
- Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
- Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
- Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
- Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
- Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
- Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
- Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
- Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
- Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
- Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
- Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
- Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
- Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
- Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
- Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
- Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
- Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
- Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
- Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
- Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
- Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
- Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
- Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
- Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).
