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Chemie

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Abstract

Dieses Protokoll identifiziert die Immunitätsproteine der bakteriziden Enzyme: Colicin E3 und Bakteriacin, die von einem pathogenen Escherichia coli-Stamm mittels Antibiotika-Induktion produziert und durch MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit selbst entwickelter Software identifiziert wurden. Das Immunitätsprotein von Colicin E3 (Im3) und das Immunitätsprotein von Bakteriacin (Im-Bac) wurden aus prominenten b- und/oder y-Typ-Fragmentionen identifiziert, die durch die Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) auf der C-terminalen Seite von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Asparaginresten durch den Asparaginsäure-Effektfragmentierungsmechanismus erzeugt wurden. Die Software scannt schnell in silico Proteinsequenzen, die aus der gesamten Genomsequenzierung des Bakterienstamms stammen. Die Software entfernt auch iterativ Aminosäurereste einer Proteinsequenz für den Fall, dass die reife Proteinsequenz abgeschnitten wird. Eine einzelne Proteinsequenz besaß Massen- und Fragmentionen, die mit denen übereinstimmten, die für jedes Immunitätsprotein nachgewiesen wurden. Die Kandidatensequenz wurde dann manuell inspiziert, um zu bestätigen, dass alle erkannten Fragmentionen zugeordnet werden konnten. Das N-terminale Methionin von Im3 wurde posttranslational entfernt, während Im-Bac die komplette Sequenz hatte. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nur zwei oder drei nicht-komplementäre Fragmentionen, die durch PBC gebildet werden, notwendig sind, um die richtige Proteinsequenz zu identifizieren. Schließlich wurde ein Promotor (SOS-Box) vor den antibakteriellen und Immunitätsgenen in einem Plasmidgenom des Bakterienstamms identifiziert.

Introduction

Die Analyse und Identifizierung unverdauter Proteine mittels Massenspektrometrie wird als Top-down-Proteomanalyse1,2,3,4bezeichnet. Es ist jetzt eine etablierte Technik, die Elektrospray-Ionisation (ESI)5 und hochauflösende Massenanalysatoren6und ausgeklügelte Dissoziationstechniken verwendet, z. B. Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD)7,ultraviolette Photodissoziation (UV-PD)8usw.

Die andere weiche Ionisationstechnik ist die matrixgestützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)9,10,11 ,die für die Top-Down-Analyse weniger umfassend verwendet wurde, zum Teil, weil sie in erster Linie an Time-of-Flight (TOF) Massenanalysatoren gekoppelt ist, die im Vergleich zu anderen Massenanalysatoren eine begrenzte Auflösung haben. Trotz dieser Einschränkungen wurden die Instrumente MALDI-TOF und MALDI-TOF-TOF für die schnelle Top-Down-Analyse von reinen Proteinen und fraktionierten und unfraktionierten Proteinmischungen eingesetzt. Für die Identifizierung reiner Proteine ist der In-Source-Zerfall (ISD) eine besonders nützliche Technik, da sie die massenspektrometrische (MS) Analyse von ISD-Fragmentionen sowie die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) von Proteinionenfragmenten ermöglicht, die sequenzspezifische Fragmente liefern, oft aus den N- und C-Termini des Zielproteins, analog zur Edman-Sequenzierung12,13 . Ein Nachteil des ISD-Ansatzes besteht darin, dass die Probe wie bei der Edman-Sequenzierung nur ein Protein enthalten darf. Die eine Proteinanforderung ist auf die Notwendigkeit einer eindeutigen Zuordnung von Fragmentionen zu einem Vorläuferion zurückzuführen. Wenn zwei oder mehr Proteine in einer Probe vorhanden sind, kann es schwierig sein, zuzuordnen, welche Fragmentionen zu welchen Vorläuferionen gehören.

Fragmention/Vorläufer-Ionen-Attribution kann mit MALDI-TOF-TOF-MS/MS adressiert werden. Wie bei jedem klassischen MS/MS-Experiment werden Vorläuferionen vor der Fragmentierung massenselektiert/isoliert, und die nachgewiesenen Fragmentionen können einem bestimmten Vorläuferion zugeschrieben werden. Die für diesen Ansatz verfügbaren Dissoziationstechniken beschränken sich jedoch auf primär hochenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (HE-CID)14 oder Post-Source-Zerfall (PSD)15,16. HE-CID und PSD sind am effektivsten bei der Fragmentierung von Peptiden und kleinen Proteinen, und die Sequenzabdeckung kann in einigen Fällen begrenzt sein. Darüber hinaus führt PSD zu einer Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) vor allem auf der C-terminalen Seite von Asparagin- und Glutaminsäureresten durch ein Phänomen, das als Asparaginsäureeffekt bezeichnet wird17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS hat auch eine Nischenanwendung bei der taxonomischen Identifizierung von Mikroorganismen gefunden: Bakterien21, Pilze22und Viren23. Zum Beispiel werden MS-Spektren verwendet, um unbekannte Bakterien durch Vergleich mit einer Referenzbibliothek von MS-Spektren bekannter Bakterien unter Verwendung von Mustererkennungsalgorithmen zum Vergleich zu identifizieren. Dieser Ansatz hat sich aufgrund seiner Geschwindigkeit und Einfachheit als sehr erfolgreich erwiesen, obwohl er eine Übernacht-Kultivierung des Isolats erfordert. Die mit diesem Ansatz nachgewiesenen Proteinionen (in der Regel unter 20 kDa) umfassen einen MS-Fingerabdruck, der eine taxonomische Auflösung auf Gattungs- und Artebene und in einigen Fällen auf der Unterart24 und Stammebene25,26ermöglicht. Es besteht jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, nicht nur potenziell pathogene Mikroorganismen taxonomisch zu klassifizieren, sondern auch spezifische Virulenzfaktoren, Toxine und Antimikrobielle Resistenzfaktoren (AMR) zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird die Masse von Peptiden, Proteinen oder kleinen Molekülen mittels MS gemessen und anschließend von MS/MS isoliert und fragmentiert.

Pathogene Bakterien tragen oft kreisförmige DNA-Stücke, die Plasmide genannt werden. Plasmide sind zusammen mit Prophagen ein Hauptvektor des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien und sind für die schnelle Ausbreitung von antibiotikaresistenzen und anderen Virulenzfaktoren über Bakterien verantwortlich. Plasmide können auch antibakterielle (AB) Gene tragen, z. B. Colicin und Bakteriacin. Wenn diese Gene exprimiert und die Proteine sezerniert werden, deaktivieren sie die Proteintranslationsmaschinerie benachbarter Bakterien, die die gleiche Umweltnische besetzen27. Diese bakteriziden Enzyme können jedoch auch ein Risiko für den Wirt darstellen, der sie produziert hat. Folglich wird ein Gen vom Wirt mitexprimiert, das spezifisch die Funktion eines AB-Enzyms hemmt und als sein Immunitätsprotein (Im) bezeichnet wird.

DNA-schädigende Antibiotika wie Mitomycin-C und Ciprofloxacin werden häufig verwendet, um die SOS-Reaktion in Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) zu induzieren, deren Shiga-Toxin-Gen(stx) sich in einem im bakteriellen Genom vorhandenen Prophagengenom befindet28. Wir haben zuvor Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS und Top-Down-Proteomanalyse verwendet, um Stx-Typen und Subtypen zu erkennen und zu identifizieren, die von den STEC-Stämmen29,30,31,32produziert werden. In der vorherigen Arbeit wurde der STEC O113:H21-Stamm RM7788 über Nacht auf Agarmedien kultiviert, die mit Mitomycin-C ergänzt wurden. Anstatt jedoch die erwartete B-Untereinheit von Stx2a bei m/z ~7816 nachzuweisen, wurde bei m/z ~7839 ein anderes Proteinion nachgewiesen und als plasmidkodiertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion33identifiziert. In der aktuellen Arbeit identifizierten wir zwei plasmidkodierte AB-Im-Proteine, die von diesem Stamm mittels Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, und Top-Down-Proteomanalyse mit eigenständiger Software hergestellt wurden, die entwickelt wurde, um in silico Proteinsequenzen zu verarbeiten und zu scannen, die aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) abgeleitet wurden. Darüber hinaus wurde die Möglichkeit von Post-Translation-Modifikationen (PTM) mit Sequenzkürzung in die Software integriert. Die Immunitätsproteine wurden mit dieser Software aus der gemessenen Masse des reifen Proteinions und sequenzspezifischen Fragmentionen aus PBC, die durch den Asparaginsäureeffekt verursacht und durch MS/MS-PSD nachgewiesen wurden, identifiziert. Schließlich wurde ein Promotor vor den AB/Im-Genen in einem Plasmidgenom identifiziert, der die Expression dieser Gene erklären könnte, wenn dieser Stamm einem DNA-schädigenden Antibiotikum ausgesetzt ist. Teile dieser Arbeit wurden auf dem National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (August 17-20, 2020)34vorgestellt.

Protocol

1. Mikrobiologische Probenvorbereitung Impfen Sie 25 ml Luria-Brühe (LB) in einem 50 mL konischen Röhrchen mit E. coli O113:H21-Stamm RM7788 (oder einem anderen Bakterienstamm) aus einem Glycerinvorrat unter Verwendung einer sterilen 1 μL-Schleife. Röhre verschließen und bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) für 4 h vorkultivieren. Aliquot 100 μL vorkultivierte Brühe und auf einer LB-Agarplatte verteilt, ergänzt mit 400 oder 800 ng / ml Mitomycin-C. Agarplatten statisch über Nacht i…

Representative Results

Abbildung 3 (oberes Bild) zeigt die MS des STEC O113:H21-Stammes RM7788, der über Nacht auf LBA mit 400 ng/ml Mitomycin-C kultiviert wurde. Peaks bei m/z 7276, 7337 und 7841 wurden zuvor als Kälteschockprotein C (CspC), Kälteschockprotein E (CspE) und ein plasmidgetragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert33. Das Proteinion bei m/z 9780 [M+H]+ wurde mittels MS/MS-PSD analysiert, wie in Abbildung 3 (unteres Bild) dar…

Discussion

Überlegungen zum Protokoll
Die Hauptstärken des aktuellen Protokolls sind seine Geschwindigkeit, die Einfachheit der Probenvorbereitung und die Verwendung eines Instruments, das relativ einfach zu bedienen, zu trainieren und zu warten ist. Obwohl bottom-up- und top-down-Proteomanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie-ESI-HR-MS allgegenwärtig und in vielerlei Hinsicht der Top-down-Analyse durch MALDI-TOF-TOF weit überlegen sind, erfordern sie mehr Zeit, Arbeit und Fachwissen. Die Komplexität v…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Protein Biomarker Seeker Software ist frei verfügbar (kostenlos) durch Kontaktaufnahme mit Clifton K. Fagerquist unter clifton.fagerquist@usda.gov. Wir möchten die Unterstützung dieser Forschung durch ARS, USDA, CRIS Grant: 2030-42000-051-00-D anerkennen.

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
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Referenzen

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Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor
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Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
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