사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology,Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education,Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research,Yikon Genomics Co. Ltd.
Summary
본 연구는 배아 생검을 피하고 NGS를 사용하여 염색체 ploidy 식별을 가능하게 하는 폐배양 배지를 사용하는 인간 배아의 염색체 스크리닝 프로토콜을 보고합니다. 본 논문에서는 배양액 제조, 전장 유전체 증폭(WGA), 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 준비, 데이터 분석 등 자세한 절차를 제시한다.
Abstract
임상 체외 수정(IVF)에서 PGT-A의 일반적인 방법은 영양배엽(TE)에서 몇 개의 세포를 생검해야 합니다. 이것이 태반을 형성하는 계통입니다. 그러나 이 방법은 전문 기술이 필요하고 침습적이며 TE의 염색체 수와 태아로 발달하는 내부 세포 질량(ICM)이 항상 동일하지 않기 때문에 위양성 및 음성이 발생합니다. TE 및 ICM에서 배양 배지로 방출된 DNA의 염기서열 분석이 필요한 기술인 NICS는 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공할 수 있지만 이전에는 효능이 제한적인 것으로 나타났습니다. 본 연구는 배양 배지 샘플링 방법, 전체 게놈 증폭(WGA) 및 라이브러리 준비, 분석 소프트웨어에 의한 NGS 데이터 분석을 포함하는 NICS의 전체 프로토콜을 보고합니다. 배아 실험실마다 동결 보존 시간이 다르다는 점을 고려하여 발생학자는 IVF 실험실의 실제 조건에 따라 선택할 수 있는 배아 배양 배지를 수집하는 두 가지 방법을 가지고 있습니다.
Introduction
보조 생식 기술(ART)은 불임 치료에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 IVF와 같은 ART의 성공률은 제한적이며, 임신 손실률은 정상 인구에 비해 현저히 높다1. 이러한 문제의 주요 원인은 착상 전 인간 배아에 일반적으로 존재하는 염색체 이상이다2. PGT-A는 착상 전에 배아의 염색체 균형을 스크리닝하는 효과적인 방법입니다 3,4. 일부 연구에서는 PGT-A가 낙태율을 낮추고 임신율을 향상시킬 수 있음을 입증했습니다 5,6,7,8. 그러나 PGT-A에는 특정 교육과 경험이 필요한 복잡한 기술 전문 지식이 필요합니다. 침습적 배아 생검 절차는 또한 잠재적으로 배아에 손상을 줄 수 있다9. 연구에 따르면 할구 생검은 후속 발달을 방해할 수 있으며, 생검된 TE의 수가 착상율에 영향을 미칠 수 있다10. 배아 생검의 장기적인 생물안전성 문제는 아직 인간을 대상으로 철저하게 평가되지 않았지만, 동물 연구에서는 배아 발달에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다11,12,13.
이전 보고에 의하면 배아 발달 과정에서 미량의 DNA 물질이 배양 배지로 분비되었으며, 사용된 배아 배양 배지 14,15,16,17,18을 사용하여 포괄적인 염색체 스크리닝(CCS)을 수행하려는 노력이 이루어졌다. 그러나 검사의 검출률과 정확도는 광범위한 임상 사용에 대한 요구 사항을 충족하지 못했습니다. 본 연구는 NICS 테스트의 정확도뿐만 아니라 검출률을 높이기 위한 NICS 분석의 개선을 보고하였다19. 최근 몇 년 동안 배반체액(BF)은 최소 침습 PGT-A의 분석 샘플로 연구되었습니다. 그러나 배반포액 샘플에서 성공적인 게놈 전체 증폭 및 검출 가능한 DNA의 비율은 34.8%에서 82%에 이릅니다20,21,22. 다양한 연구에서 보고된 BF의 부피는 0.3nL에서 1μL 사이입니다. BF에서 DNA의 양이 적다는 점을 고려하여, 배반포액과 배양 배지를 혼합하여 cell-free DNA의 양을 증가시켜 검출의 성공률과 일관성을 향상시킬 수 있습니다. Kuznyetsov 외.23 및 Li et al.24는 zona pellucida를 레이저로 처리하고 배반포액을 배양 배지에 방출하여 배아 DNA의 총량을 개선시켰으며, WGA 후 결합된 배지/BF 샘플의 증폭률은 각각 100% 및 97.5%였습니다. Jiao et al.25도 동일한 방법을 사용하여 100% 증폭 성공률을 얻었습니다.
본 연구는 사용한 배지 샘플 준비, NGS 준비 및 데이터 분석을 포함하는 자세한 프로토콜을 보고합니다. 본 연구는 난모세포에서 적운 세포를 조심스럽게 제거하여 세포질 내 단일 정자 주입(ICSI) 및 배반포 배양을 수행했습니다. 4일-5일/6일 소요 배지를 WGA 및 NGS 라이브러리 준비를 위해 수집했습니다. 본 연구는 NICS 기술을 사용하여 약 3시간 만에 WGA 및 NGS 라이브러리 준비 단계를 간소화하고 약 9시간 만에 비침습적으로 CCS 결과를 얻었습니다.
Protocol
북경대학 제3병원 윤리위원회로부터 윤리 허가를 받았다. 1. 준비 알림: 필요한 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 시약사용하기 전에 Tri-gas 인큐베이터에서 37°C, 5% CO 2 및 5% O2에서 20-30μL의 배우자 배지/수정 배지 및 분열/배반포 단계 배양 배지(미네랄 오일로 덮임) 및 히알루로니다아제(단단히 뚜껑이 있는 ?…
Representative Results
본 연구는 제안된 방법을 환자에게 적용하였다. NICS 분석을 적용하기 전에 IRB 승인 및 사전 동의를 받았습니다. 본 연구는 환자로부터 6개의 배반포를 채취하고 4일차에서 5일차에 걸쳐 6개의 배아 모두에 대해 NICS를 수행했습니다. 부모의 균형 전위로 인한 염색체 이상은 NICS 분석으로 5개의 염색체에서 발견되었습니다. 따라서 전송에 사용할 수 없습니다(그림 4A-E</stron…
Discussion
수정 및 문제 해결
NICS 결과가 부모의 유전 물질로 오염된 경우 모든 적운-코로나 방사능 세포를 제거하고 수정을 위해 ICSI를 수행해야 합니다. DNA를 저하시킬 수 있는 부적절한 배지 보관 또는 템플릿 준비 프로세스를 피할 수 있습니다. 작업 공간은 DNase 및 RNase 오염 제거 시약으로 철저히 정제되었습니다. 다른 배아로부터의 오염을 피하기 위해, 4일째부터 시작?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 NGS 데이터 분석에 도움을 준 Shiping Bo와 Shujie Ma에게 감사의 뜻을 전합니다. 자금 지원: 이 연구는 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 번호 2018YFC1003100)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
Referenzen
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Diesen Artikel zitieren
Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).