Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Summary

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Abstract

Ioniserende straling is een krachtige inductor van DNA-schade en een goed gedocumenteerd carcinogeen. Biologische dosimetrie omvat de detectie van biologische effecten veroorzaakt door blootstelling aan ioniserende straling om een individuele dosisbeoordeling uit te voeren. Dit is relevant in het kader van stralingsnoodsituaties, waar gezondheidsbeoordelingen en planning van klinische behandeling voor blootgestelde slachtoffers van cruciaal belang zijn. Aangezien DNA double streng breaks (DSB) worden beschouwd als de meest dodelijke vorm van door straling geïnduceerde DNA-schade, presenteert dit protocol een methode om DNA DSB in bloedmonsters te detecteren. De methodologie is gebaseerd op de detectie van een fluorescerend gelabeld gefosforyleerd DNA-reparatie-eiwit, namelijk γ-H2AX. Het gebruik van een geautomatiseerd microscopieplatform om het aantal γ-H2AX-foci per cel te scoren, maakt een gestandaardiseerde analyse mogelijk met een significante afname van de doorlooptijd. Daarom heeft de γ-H2AX-test het potentieel om een van de snelste en gevoelige testen voor biologische dosimetrie te zijn. In dit protocol zullen volbloedmonsters van gezonde volwassen vrijwilligers in vitro worden verwerkt en bestraald om het gebruik van de geautomatiseerde en gevoelige γ-H2AX foci assay voor biodosimetrietoepassingen te illustreren. Er wordt gebruik gemaakt van een geautomatiseerd diascansysteem en analyseplatform met een geïntegreerde fluorescentiemicroscoop, die het mogelijk maakt om DNA DSB snel en automatisch te scoren met een verminderde mate van bias.

Introduction

Sinds de ontdekking is ioniserende straling (IR) een onmisbaar hulpmiddel geworden in de huidige medische en industriële praktijken, evenals in agrarische en militaire toepassingen. Het brede gebruik van IR verhoogt echter ook het risico op overbelichting van straling voor zowel professionele stralingswerkers als leden van het publiek. IR is een bekende fysische kankerverwekkende stof die op een directe of indirecte manier DNA-schade kan veroorzaken, wat leidt tot aanzienlijke gezondheidsrisico’s ^1,2. Daarom is het belangrijk om een dosisbeoordeling uit te voeren, omdat de mate van blootstelling een belangrijke eerste stap vormt in het beheer van het stralingsongeval ¹.

In het geval van grootschalige nucleaire of radiologische noodsituaties kan het aantal dosisbeoordelingen dat moet worden uitgevoerd variëren van enkele tot duizenden mensen, afhankelijk van de grootte van het ongeval³. In deze scenario’s kan fysieke dosimetrie ook dubbelzinnig zijn (bijvoorbeeld als de dosimeter niet goed wordt gedragen) of niet beschikbaar zijn, wanneer leden van het publiek betrokken zijn. Hoewel klinische symptomen kunnen worden gebruikt voor triage, zijn ze niet noodzakelijkerwijs stralingsspecifiek en kunnen ze resulteren in een valse diagnose. Daarom is het raadzaam om biologische dosimetrie te gebruiken naast fysieke dosimetrie en klinische beoordelingen. Deze methode maakt de analyse van door straling geïnduceerde veranderingen op cellulair niveau mogelijk en maakt de ondubbelzinnige identificatie mogelijk van blootgestelde personen die medische behandeling nodig hebben⁴. De arts kan deze biologische dosisbeoordeling vervolgens gebruiken als aanvulling op fysieke dosisreconstructies en andere klinische diagnoses, om de juiste medische zorg voor te schrijven⁵. De behoefte aan biologische dosimetrie zal vooral hoog zijn voor triage en medisch beheer van slachtoffers wanneer het blootstellingsscenario niet goed bekend is en wanneer de slachtoffers lid zijn van het publiek. Het belangrijkste doel van triage is om “bezorgde goed” personen, die prodromale symptomen kunnen hebben maar die geen hoge dosis hebben gekregen, effectief te onderscheiden van blootgestelde personen die onmiddellijke medische hulp en gespecialiseerde zorg nodig hebben. Het drempelniveau van stralingsdosis dat stralingsziekte kan veroorzaken is ongeveer 0,75 – 1,00 Gy. Vervolgens lopen die personen die > 2 Gy blootstelling krijgen een hoger risico op acuut stralingssyndroom en moeten ze een snelle medische behandeling^{krijgen 6,7}. Tijdige en nauwkeurige biologische dosisschattingen voor slachtoffers die gevangen zitten in het kruisvuur van dergelijke rampen zijn van cruciaal belang. Bovendien kan het ook minimaal blootgestelde slachtoffers troosten en geruststellen⁸.

Stralingsbeschermingsautoriteiten gebruiken verschillende biodosimetriemarkers, die voornamelijk gebaseerd zijn op de detectie van cytogenetische schade, zoals dicentrische chromosomen of micronuclei, in gekweekte menselijke lymfocyten⁹. De detectie van cytogenetische schade kan ook worden uitgevoerd door de fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) translocatie assay¹⁰. Het grote nadeel van de conventionele cytogenetische methoden is echter de lange doorlooptijd om de resultaten in een noodsituatie te verkrijgen⁸.

Een van de vroegste stappen in het DNA DSB-herkenningsproces is de fosforylering van de histonvariant H2AX, wat leidt tot de vorming van γ-H2AX en de daaropvolgende rekrutering van reparatiefactoren. In het afgelopen decennium heeft de detectie van door straling geïnduceerde γ-H2AX-foci in perifere bloedlymfocyten met behulp van immunofluorescentiemicroscopie steeds meer aandacht gekregen als een betrouwbaar biologisch dosimetrie-instrument^{11,12,13,14,15}. Afhankelijk van de stralingskwaliteit en het celtype wordt de maximale opbrengst van γ-H2AX-foci gedetecteerd binnen 0,5 – 1 uur na bestraling^16,17. Er wordt verwacht dat er een nauwe correlatie is tussen het aantal DNA DSB en γ-H2AX-foci, evenals tussen het verdwijnen van foci en DSB-reparatie. Laserschaarexperimenten met een gepulseerd lasermicroeam hebben aangetoond dat γ-H2AX-foci lokaliseren naar de plaatsen van DNA DSB¹⁸. Hoewel het een onderwerp van actief debat blijft, suggereerde een van de vroegste studies met ¹²⁵I een één-op-één correlatie tussen het berekende aantal desintegraties per cel (representabel voor het aantal door straling geïnduceerde DNA DSB) en het aantal γ-H2AX-foci dat werd gescoord^19,20.

In het afgelopen decennium heeft de Europese Unie de multibiodose-projecten (multidisciplinaire biodososimetrische instrumenten om radiologische slachtoffers op grote schaal te beheren) en RENEB-projecten (Realizing the European Network of Biodosimetry) gefinancierd om een duurzaam netwerk in biologische en retrospectieve dosimetrie te creëren^21,22. Dit project omvatte verschillende laboratoria in heel Europa om de noodresponscapaciteiten in geval van stralingsgevaar te evalueren.^14,21,22. De γ-H2AX foci assay heeft een aantal aanzienlijke voordelen, zoals een snelle verwerkingstijd, het potentieel voor batchverwerking waardoor een hoge doorvoer mogelijk is, evenals de hoge gevoeligheid bij gebruik binnen een paar uur na blootstelling^13,23,24. De hoge gevoeligheid van de test in het lage dosisbereik resulteerde in een aantal studies waarbij de γ-H2AX foci assay werd gebruikt als indicator van het effect van medische blootstelling aan straling, zowel in radiotherapie als in diagnostische beeldvormingstoepassingen^{25,26,27,28,29,30}. Deze kenmerken maken de γ-H2AX foci assay een zeer concurrerend alternatief voor andere methoden voor vroege triage bij grote nucleaire ongevallen om de kritisch blootgestelde van laagrisico personen te scheiden. Verschillende optimalisatie-experimenten hebben aangetoond dat het mogelijk is om de γ-H2AX foci assay uit te voeren met kleine hoeveelheden bloed, zoals de studie van Moquet et al. die meldden dat het haalbaar is om de γ-H2AX foci assay uit te voeren met slechts een druppel bloed (vingerprik)³¹. Een vergelijkbare aanpak werd gebruikt bij de ontwikkeling van het volledig geautomatiseerde high-throughput RABIT-systeem (Rapid Automated Biodosimetry Tool), dat werd geoptimaliseerd om γ-H2AX-opbrengsten te meten van van vingerprikken afgeleide bloedmonsters^32,33. Over het algemeen suggereren de resultaten van de multibiodose- en RENEB-vergelijkingsstudies dat de γ-H2AX-foci-assay een zeer nuttig triage-instrument zou kunnen zijn na een recente (tot 24 uur) acute blootstelling aan straling^12,13,14. In een intervergelijkingsstudie met een laag dosisbereik kon een dosis zo laag als 10 mGy worden onderscheiden van de schijnbestraalde controlemonsters, wat de gevoeligheid van de test in het lage dosisbereik benadrukte³⁴. Het is belangrijk op te merken dat de hoge gevoeligheid van de test met name geldt voor lymfocyten, waardoor ze een van de meest geschikte celtypen zijn voor de evaluatie van blootstellingen aan lage doses. Lymfocyten zijn voornamelijk niet-fietsende cellen en vertegenwoordigen een synchrone populatie. Dit laatste vermijdt expressie van γ-H2AX geassocieerd is met DNA-replicatie, wat de gevoeligheid van de test om stralingsgeïnduceerde DSB te detecteren tijdens G2- en S-fase van de celcyclus aanzienlijk vermindert³⁵. Naast de gevoeligheid voor lage doses voor lymfocyten, is de doorlooptijd van de γ-H2AX foci assay aanzienlijk sneller dan cytogenetische technieken zoals de dicentrische en micronucleus assay, omdat het geen stimulatie van lymfocyten vereist. Daarom kunnen resultaten binnen enkele uren worden verkregen in vergelijking met een paar dagen voor cytogenetische technieken. Een groot nadeel van de test is de snelle verdwijning van het γ-H2AX-focisignaal, dat normaal gesproken binnen enkele dagen na de blootstelling aan straling tot uitgangsniveaus zal worden teruggebracht, afhankelijk van de DNA-reparatiekinetiek³⁶. Daarom is de meest geschikte toepassing van de test in een biodosimetriecontext voor initiële triagedoeleinden en om prioriteit te geven aan meer tijdrovende cytogenetische biologische dosimetrie-follow-up voor bepaalde slachtoffers. Voor nauwkeurige retrospectieve biodosimetrie en langetermijneffecten moet men echter vertrouwen op cytogenetische technieken zoals driekleurige FISH-analyses voor de detectie van stabiele chromosomale afwijkingen in het geval de blootstelling enkele jaren geleden plaatsvond¹⁰.

Als onderdeel van verschillende biodosimetrie-initiatieven zijn meerdere assays geëvalueerd voor triagedoeleinden naast de γ-H2AX foci assay om mensen in grootschalige radiologische noodsituaties te triage; zoals de dicentrische test, de cytokinese-blok micronucleus assay, elektron paramagnetische resonantie (EPR), serum eiwit assay (SPA), huid spikkel assay (SSA), optisch gestimuleerde luminescentie (OSL), evenals genexpressie analyse ^37,38. De γ-H2AX foci assay kan kwantitatief worden gebruikt voor de evaluatie van DNA DSB-vorming en reparatie³⁹. De test is echter tijdsafhankelijk omdat het niveau van γ-H2AX-foci varieert met de tijd na bestraling als gevolg van de DNA DSB-reparatiekinetiek⁴⁰. Een vergelijkende studie illustreerde dat microscopische scoring met z-fase capaciteit de meest nauwkeurige resultaten biedt na 1 Gy bestraling, terwijl flowcytometrie alleen betrouwbare resultaten geeft bij hogere doses IR⁴¹. Er zijn veel rapporten over de ontwikkeling van beeldanalyse-oplossingen voor gebruik bij geautomatiseerde scores^{42,43,44,45,46.} In dit protocol wordt een geautomatiseerd fluorescerend microscopieplatform met hoge doorvoer gebruikt om γ-H2AX-foci in perifere bloedlymfocyten te analyseren. Het gebruik van een automatisch scoresysteem vermijdt zowel interlaboratorium- als interwaarnemer scoringsbias, terwijl het nog steeds voldoende gevoeligheid mogelijk maakt om doses onder 1 Gy⁴⁷te detecteren. Het belangrijkste voordeel van dit systeem ten opzichte van gratis open-source software voor foci scoring is het feit dat het volledige proces van het scannen van dia’s tot het vastleggen en scoren geautomatiseerd is. Het concept van door de gebruiker definieerbare en op te slaan classificatoren garandeert reproduceerbaarheid die een onbevooroordeelde mate van kwaliteit aan de resultaten toevoegt. Daarom illustreert dit werk hoe γ-H2AX-foci-resultaten kunnen worden verkregen met behulp van een geautomatiseerde microscopische scan- en scoringsmethode die kan worden gebruikt wanneer bloedmonsters van mogelijk overbelichte personen worden ontvangen door radiobiologische laboratoria voor biologische dosimetriedoeleinden.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Biomedical Research Ethics Committee van de University of Western Cape Ethics Committee – Code BM18/6/12. 1. Bereiding van oplossingen48 Oplossing voor celfixatie (3% PFA in PBS) Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en werk in een zuurkast, voeg 20 g paraformaldehyde toe aan 200 ml gedestilleerd H2O. Verwarm het mengsel tot 60 °C om het oplossen te vergemakkelijken. Zodra de PFA is opgelost, voeg je 40 druppels van 5 N NaOH voorzichtig toe gedurende 30 minuten en af te koelen tot kamertemperatuur. Pas aan tot pH 7 met 1 M HCl en vul aan tot een eindvolume van 250 ml met gedestilleerd H2O (aliquots kunnen gedurende 1 jaar bij -20 °C worden bewaard). Voeg 25 ml van deze oplossing toe aan 41,7 ml PBS om een 3% PFA-oplossing te betalen. 1% BSA-oplossing (Bovine Serum Albumin): Voeg 10 g BSA toe aan 1000 ml PBS en meng tot het is opgelost. Bewaren bij 4 °C tot gebruik (maximaal 72 uur). Triton-X Oplossing in een concentratie van 1:500: Voeg 1 μL Triton-X toe aan 500 μL PBS, bewaar bij 4 °C tot gebruik (maximaal 24 uur). Antilichaam oplossingen Primair antilichaam – Anti-γ-H2AX in een concentratie van 1:500: Voeg 1 μL anti-γ-H2AX toe aan 500 μL 1% BSA-oplossing, bewaar bij 4 °C tot gebruik (maximaal 24 uur). Secundair antilichaam – DAM-TRITC in een concentratie van 1:1000: Voeg 1 μL DAM-TRITC toe aan 1000 μL 1% BSA-oplossing, bewaar bij 4 °C tot gebruik (maximaal 24 uur). Complete Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Media Voeg gefilterd foetaal runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine toe aan RPMI 1640-media in een steriele fles om een uiteindelijke concentratie van 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine te geven. 2. Voorbereiding van monsters OPMERKING: Voor dit protocol worden perifere volbloedmonsters verzameld door venapunctuur in lithium-heparine-verzamelbuizen van gezonde volwassen vrijwilligers (met geïnformeerde toestemming – BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee van de Ethische Commissie van de Universiteit van West-Kaap). Zorg er voordat u begint voor dat het bloed en het dichtheidsmedium van 1,077 g / ml zijn gewend aan kamertemperatuur. Verdun in een voorbereide bioveiligheidskast het perifere volbloed in een 1:1-volume met PBS en leg het verdunde bloed voorzichtig op een gelijk volume tot twee volumes medium met een dichtheid van 1,077 g / ml. Het is belangrijk om het bloed geleidelijk op het dichtheidsmedium te leggen door de buis schuin op 45 ° te houden, zodat het bloed en het dichtheidsmedium niet mengen. Breng de suspensie voorzichtig over in een centrifuge en draai gedurende 20 minuten op 900 x g. Pipetteer daarna de ‘troebele’ laag alleen naar een nieuwe steriele conische buis en vul de buis met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1000 x g. Zuig daarna het supernatant op met een pipet, wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren, suspend de PBMC-pellet zorgvuldig in 1 ml PBS en vul de buis met PBS. Herhaal de bovenstaande wasstap nog twee keer om tot een totaal van drie wasbeurten te komen. Tel het aantal PBMC’s met behulp van een hemocytometer, in het besef dat elke ml perifeer bloed van een volwassen donor zal resulteren in een ruw gemiddelde van 1 – 1,5 x 106 PBMC’s49. Verdun na het tellen de PBMC-pellet tot een concentratie van 8 x10 5 lymfocyten in 1 ml cRPMI. Voeg vervolgens ongeveer 2 x 106 PBMC’s of 2,5 ml van de geïsoleerde PBMC-oplossing toe aan een steriele, conische buis voor bestralingen. 3. Bestralingen van monsters LET OP: Behandel de stralingseenheid volgens de richtlijnen voor stralingsbescherming en draag te allen tijde een fysieke dosimeter. Zorg ervoor dat het gebruikte bestralingssysteem zo is gekalibreerd en ingesteld dat de juiste verwachte doses worden bereikt. Bestraal PBMC’s bij kamertemperatuur met behulp van een 60Co-bron. Kalibreren (TRS-398 protocol) met een Farmer 117 kamer waarvoor een kamerkalibratiefactor verkregen van het National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50. Plaats voor deze test de conische buizen tussen een acrylplaat van 5 mm (gebruikt voor de opbouw van balken) en 50 mm backscattermateriaal met het huidige 60Co-brondosistempo van 0,57 Gy /min voor een 300 mm × 300 mm homogene veldgrootte bij 750 mm bron-tot-oppervlakteafstand. Bestraal de PBMC’s met graduele doses van 0,125, 0,500, 1,000, 1,500 en 2,000 Gy en bewaar de schijnbestraalde controlemonsters in de controlekamer, die alleen blootstelling aan omgevingsstraling ontvangen. Incubeer de bestraalde monsters gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator om het maximale aantal γ-H2AX-foci te bereiken.OPMERKING: Incubatietijd kan worden gewijzigd volgens experimenteel ontwerp. 4. Diavoorbereiding OPMERKING: Zie afbeelding 1 voor het instellen van dia’s. Bereid 3 dia’s (technische herhalingen) voor met behulp van dia’s bedekt met een positief geladen oppervlak om de hechting per bestralingsconditie (of per conische buis) te verbeteren. Plaats de schuif in de cliphouder, voeg de filterkaart erop toe en ten slotte de trechter. Bevestig de schuifclips en plaats ze in de cytocentrifuge. Voeg 250 μL van de celsuspensie toe aan de trechter (200.000 cellen/dia) en draai gedurende 5 minuten gedurende 30 x g met behulp van een cytocentrifuge. Verwijder na cytocentrifugatie de dia van de cliphouder en teken met een hydrofobe pen een cirkel rond de plek met de cellen om de immunofluorescente vlek op de gebonden cellen te behouden tijdens het kleuringsproces. 5. Fixatie en immunofluorescentie γ-H2AX kleuring OPMERKING: Alle oplossingen worden zorgvuldig direct toegevoegd aan het celgebied dat wordt gemarkeerd door een hydrofobe cirkel. Kleuringsoplossingen worden iets boven de dia gedoseerd zonder dat de pipetpunt de cellen verstoort. Oplossingen worden NIET toegevoegd aan de hele dia. Bevestig de glaasjes in vers bereide 3% PFA gedurende 20 minuten.OPMERKING: De dia’s kunnen worden bewaard in PBS met 0,5% PFA bij 4 °C gedurende maximaal 2 dagen voordat immunostaining wordt uitgevoerd. Was daarna de glijden in een Coplin-pot met PBS gedurende 5 minuten en bedek de cellen vervolgens gedurende 10 minuten met 100 μL van de koude Triton-X-oplossing om permeabilisatie mogelijk te maken. Tip de Triton-X-oplossing op tissuepapier en was de dia’s driemaal in 1% BSA-oplossing gedurende 10 minuten. Dit wordt gedaan om ongewenste achtergrond te voorkomen door niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren. Incubeer dia’s bij kamertemperatuur met 100 μL van het 1:500 verdunde primaire anti-γ-H2AX-antilichaam gedurende 1 uur in een bevochtigingskamer, eenvoudig te bereiken door nat tissuepapier toe te voegen aan de basis van een rechthoekige schuifopslagdoos. Tip de antilichaamoplossing op tissuepapier en voer drie wasbeurten uit met 1% BSA-oplossing gedurende 10 minuten in een Coplin-pot om ongebonden primair antilichaam te verwijderen en niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam te voorkomen. Incubeer dia’s met 100 μL van de 1:1000 verdunde secundaire DAM-TRITC-antilichaamoplossing gedurende 1 uur in de bevochtigingskamer. Tip de antilichaamoplossing op tissuepapier en was de dia’s in PBS drie keer gedurende 10 minuten. Droog ten slotte de dia’s buiten de hydrofobe cirkel met zacht, stofvrij tissuepapier en voeg 1-2 druppels DAPI toe in een waterig montagemedium en bedek de dia voorzichtig met een afdekslip van 24 x 50 mm, zorg ervoor dat er geen opgesloten luchtbellen zijn en plaats deze ‘s nachts bij 4 °C in de koelkast. Dia’s kunnen maximaal 2 weken voor het scannen bij 4 °C worden bewaard. 6. Geautomatiseerd scannen en scoren van dia’s OPMERKING: Het scansysteem moet een fluorescerende microscoop hebben, een CCD-camera met hoge resolutie (charged coupled device) die is aangesloten op een frame grabber voor real-time digitalisering van videobeelden, een scanfase, trackball voor handmatige bewegingen, 3D-muis, snelle pc en monitor, en harde schijf voor archivering(Figuur 2). Classifier instellenOPMERKING: De classificator is een set parameters die bepalen hoe het systeem cellen detecteert. Het is het resultaat van de training op basis van vooraf geclassificeerde beeldvelden. Een classificator is specifiek voor een microscoopvergroting, celtype en laboratorium. Classificatoren kunnen daarom wijzigingen in de volgende parameters vereisen om ze aan de huidige omstandigheden aan te passen. Het wordt aanbevolen om de instellingen te testen met een referentiedia voordat u gaat evalueren. Beeldacquisitie: gebruik een 40x droge doelstelling voor beeldvorming. Als u een vergelijkbare beeldkwaliteit in alle cellen wilt bereiken, stelt u de camera-integratietijd in op de automatische modus. Stel de maximale integratietijd in op ten minste 1 seconde voor beide kleurkanalen (camerawinst 4.0). Het signaalkanaal wordt verkregen met 10 scherpstelvlakken en 14/40 μm tussen de vlakken. Celselectie: PBMC’s binnen een bereik van 20,00 μm2 en 76,00 μm2 worden gedetecteerd. Stel de maximale concaviteitsdiepte in op 0,05 en de maximale hoogte-breedteverhouding op 1,4. Stel de relatieve grijsniveaudrempel in op 20%. Celverwerking: Verwerk het DAPI-counterstain-kanaal met een histogrammaximumalgoritme om de achtergrond te verkleinen. Het signaalkanaal wordt verwerkt met een TopHat-filter (sterkte 7, afvlakkingsfactor 0) om de achtergrond te verminderen en de signalen te verbeteren. Signaaltelling: tel foci met behulp van de objecttellingfunctie van het apparaat. Om vals-positieve evaluatie van resterende achtergrondsignalen te voorkomen, worden alleen die signalen geteld die ten minste 30% van de intensiteit vertonen in vergelijking met het helderste object in de cel. Plaats dia’s op het geautomatiseerde scanplatform of de schuiftrap, na voorzichtig gereinigd met 70% ethanol, om stof te verwijderen. Dia-instelling – Dialoogvenster Dia-instelling openen (Afbeelding 3) Selecteer het juiste gegevenspad, dit geeft aan waar de diabestanden die het resultaat zijn van de zoekopdracht worden opgeslagen. Geef de dia een naam, elke dia moet een unieke naam krijgen. Als een reeks dia’s wordt ingevoerd in de vorm van een opgesomde lijst, kan de ‘?’ worden gebruikt als jokerteken voor het dianummer. Selecteer de juiste classificator, zoals beschreven in rubriek 1.1 – 1.4(figuur 4). Selecteer het zoekvenster en selecteer Vooraf gedefinieerd als er een zoekvensterdefinitie bestaat die overeenkomt met de cytocentrifugecelcirkel, selecteer de betreffende definitie in de kolom Grootte of selecteer Handmatig als er geen vooraf gedefinieerde zoekvensterdefinitie beschikbaar is. In dit geval hoeft de kolom Grootte niet te worden ingesteld. Selecteer Maximum cell count en voeg het maximale aantal cellen toe dat moet worden gescand. De zoekopdracht wordt beëindigd, zelfs als het geselecteerde zoekvenster nog niet volledig is gescand zodra het maximale aantal cellen is bereikt. Voor biodososimetrietoepassingen is een geautomatiseerde score van 1000 cellen per dia voldoende, aangezien er 3 dia’s per bloedmonster worden bereid. Klik op OK om de instellingen te bevestigen. Dia scannen instellen Klik op de knop Zoeken in de zijbalk. Als de instelling Handmatig zoekvenster is geselecteerd in dia-instelling, wordt een dialoogvenster geopend waarmee het scangebied kan worden bepaald(afbeelding 5). Door het doel 10x te gebruiken, selecteert u het rechthoekige zoekgebied op de dia interactief door twee hoeken van het zoekveld te bevestigen met de linkermuisklik. Dit kan worden bevestigd met de knop OK. Als het zoekvenster verwijst naar een vooraf gedefinieerd zoekvenster, wordt deze stap weggelaten. De gebruiker wordt gevraagd een focusstartpositie aan te passen. Een referentieobject wordt dan automatisch geselecteerd, de software zal de gebruiker vragen om een referentiekern (met behulp van het 40x-objectief) voor elke dia scherp te stellen en te centreren en om instellingen te bevestigen met OK. Het systeem gaat automatisch naar alle dia’s achter elkaar. Pas indien nodig Live Image Setup – Integratietijd aan voor deze stap(Afbeelding 5). Controleer alle microscoopinstellingen en bevestig de systeemprompt met OK. Het systeem start de geautomatiseerde scherpstel- en scanprocedure. Zodra het scannen is voltooid, worden de gegevens opgeslagen op de computer voor analyses. Het scansysteem wordt automatisch uitgeschakeld nadat de scan is voltooid.OPMERKING: Zorg ervoor dat de hendel van de microscoopbuis zich in een positie bevindt die al het licht naar de camera afleidt. Einde van de zoekopdracht wordt de zoekopdracht beëindigd als de hele zoekopdracht is gescand, als het maximale aantal cellen is bereikt of als de zoekopdracht is geannuleerd. Dia-analyseOPMERKING: De voltooide scan wordt weergegeven in figuur 6. Wanneer de scan is voltooid, klikt u op de knop Galerij op de zijbalk. Bekijk de galerie, die bestaat uit kleine afbeeldingen van gedetecteerde cellen. Geef in dit venster (Figuur 7) op of de cellen die in de galerie zijn opgeslagen volgens een criterium dat moet worden gekozen uit een vervolgkeuzemenu. Cellen worden over het algemeen weergegeven in de volgorde waarin ze zijn gedetecteerd. Klik op Quality Histogram/Feature Value Diagram (Figuur 8)om de verdeling van de kwaliteitsmaatstaf voor de gedetecteerde cellen, evenals de middelen en de standaarddeviatie van de gescoorde foci weer te geven.

Representative Results

Voor dit protocol werden menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PMBC’s) geïsoleerd uit volbloed van vier gezonde volwassen vrijwilligers en werden ze blootgesteld aan stralingsdoses van 0,125, 0,250, 0,500, 1,000 en 2,000 Gy. Daarna werden de monsters gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd in een bevochtigde 5% CO2-incubator. Na fixatie en immunofluorescentiekleuring worden de dia’s automatisch gescand en gescoord. Figuren 6,7 en 8 geven een weergave van wat de software aan de gebruiker uitvoert. Zodra de scan is voltooid, verschijnt er een analysevenster met een overzicht van de gescoorde foci. De galerij geeft alle foci gescoord met een interactief menu dat uitschieters kan verwijderen en tot slot wordt een histogram met een gedetailleerde gegevenssamenvatting gegeven. De γ-H2AX-fociopbrengst na blootstelling aan γ zijn weergegeven in figuur 9. Er was een geleidelijke toename van het aantal γ-H2AX-foci met toenemende dosis. Deze grafiek illustreert niet alleen de dosisafhankelijkheid en gevoeligheid van de test, maar de pasvorm kan ook worden gebruikt om een dosisschatting uit te voeren wanneer een monster wordt ontvangen van een persoon die is blootgesteld aan een onbekende dosis. Het is belangrijk op te merken dat men geen schijnbestraalde controle of achtergrond foci niveaus voor dit individu zal hebben. Daarom omvat figuur 9 de 0 Gy-waarde van de door schijnbestraalde controlemonsters, die 0,57 ± 0,23 Gy was voor de vier volwassen donoren in deze studie. Figuur 1: Voorbereiding van dia’s voorcytocentrifugatie. Plaats de schuif in de cliphouder, voeg de filterkaart erop toe en ten slotte de trechter. Bevestig de schuifclips en plaats ze in de cytocentrifuge. Verwijder na cytocentrifugatie de dia van de cliphouder en teken een cirkel rond de plek met de cellen met behulp van een hydrofobe pen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Het geautomatiseerde scanplatform dat in dit protocol werd gebruikt, met een geautomatiseerde scanner die aan een fluorescerende microscoop is bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Menu voor het instellen van dia’s. Open het dialoogvenster door op de knop SETUP in de navigatiekolom te klikken. Selecteer of voer de doelmap voor de resultaatbestanden in Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Classifier Setup Menu. Zorg ervoor dat de geselecteerde classificatie-instellingen overeenkomen met het huidige celtype, de voorbereidingsomstandigheden en de kleurpatronen van het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Setup menu voor Handmatige Zoek venster. Venster is geselecteerd in dia-instelling; er wordt een dialoog geopend waarmee het scangebied kan worden bepaald. Door het doel 10x te gebruiken, wordt het rechthoekige zoekgebied op de dia interactief geselecteerd door twee hoeken van het zoekveld te bevestigen met de linkermuisklik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Analysevenster, zodra de scan is voltooid, toont het analysevenster de resultaten van de scan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Afbeelding 7: Galerijweergave voor de geselecteerde dia. Het tabblad Galerij bevindt zich op de zijbalk. De afbeeldingengalerij bestaat uit kleine afbeeldingen van de gedetecteerde cellen, weergegeven als een gecombineerde DAPI-TRITC-afbeelding. In de linker- en rechterbenedenhoek van elke afbeelding worden het directe aantal foci en de gecorrigeerde foci counts weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Histogramafbeeldingen voor de geselecteerde dia. Dit venster wordt geopend door met de rechtermuisknop op het histogram te klikken. Door op het histogram te klikken, biedt het tabblad histogram een gegevensoverzicht met de gemiddelde, standaarddeviatie, variatiecoëfficiënt, minimum-, maximum- en mediane waarden van de geanalyseerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Het aantal γ-H2AX-foci als functie van de dosis voor lymfocyten blootgesteld aan 60Co γ-stralen. De foutbalken zijn de standaarddeviaties die de interindividuele variatie tussen de donoren vertegenwoordigen. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde aantal γ-H2AX-foci ± standaarddeviatie van vier gezonde vrijwilligers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de geautomatiseerde fluorescerende microscopie-gebaseerde scoring van de γ-H2AX foci assay. Het illustreert het nut van de foci-assay als een tijdsefficiënte methode voor het analyseren van het aantal door straling geïnduceerde DNA DSB in perifere bloedlymfocyten om een biologische dosisbeoordeling uit te voeren in een stralingsongevalscenario waarbij individuen kunnen worden blootgesteld aan onbekende niveaus van IR.

In dit specifieke protocol werden PBMC’s in vitro bestraald om een in vivo blootstelling aan straling na te bootsen. Zodra de bestraling en de incubatietijd van een uur is voltooid, worden dia’s gemaakt met behulp van een cytocentrifuge om een concentratieplek van cellen op de dia te creëren. Het gebruik van een cytocentrifuge is van vitaal belang om gestandaardiseerde omstandigheden voor geautomatiseerde scoring te bereiken. Na voltooiing wordt een hydrofobe pen gebruikt om een cirkel rond de cellen te maken, om verspilling van reagentia te verminderen door de gebruiker in staat te stellen de kleuringsreagentia te lokaliseren. Dit type pen kan worden gebruikt in verschillende immunostainingtechnieken, zoals op paraffinesecties, bevroren secties en cytologiepreparaten. Verder is het belangrijk om een hydrofobe pen te selecteren die compatibel is met enzym- en fluorescerende detectiesystemen. Na de voorbereiding van de dia trad de fixatie en immunofluorescentie γ-H2AX-kleuring op. In dit protocol worden de cellen gedurende 20 minuten gefixeerd met behulp van 3% PFA in een PBS-oplossing. Om immunostaining te laten slagen, is het essentieel dat de morfologie van de cellen behouden blijft en dat de antigene plaatsen toegankelijk zijn voor de detectiereagentia die worden gebruikt. PFA is een relatief zacht middel voor fixatie en stabiliseert cellen met behoud van eiwitstructuren⁵¹. Optimalisatie-experimenten met hogere PFA-concentraties en langere fixatietijden resulteerden in een negatieve impact op de glijkwaliteit, maar verdere opslag (‘s nachts) in 0,5% PFA tot 24 uur leverde goede resultaten op.

Het primaire, 2F3 monoklonale antilichaam dat in dit protocol wordt gebruikt, reageert op histonvariant H2AX wanneer gefosforyleerd bij Serine 139 na DNA DSB-inductie. Het antilichaam kan binden aan het gefosforyleerde residu zonder kruisreactiviteit met andere gefosforyleerde histonen⁵². Aangezien dit een primair monoklonaal antilichaam van de muis is, werd een secundair antilichaam geselecteerd tegen de gastheersoort van het primaire antilichaam terwijl het werd opgevoed in een alternatieve gastheer, namelijk ezel-anti-muis (DAM)-TRITC. Hoewel immunofluorescente kleuring is gebaseerd op specifieke antilichaam-epitoopbinding, kunnen verschillende intermoleculaire krachten ook resulteren in niet-specifieke achtergrondkleuring. Om niet-specifieke binding te verminderen, is het belangrijk om een blokkerend reagens te gebruiken in immunofluorescente kleuringsprotocollen⁵³; we gebruikten een BSA-oplossing. Bovendien moet voldoende tijd worden besteed aan deze blokkerende stap door de dia’s ten minste 20 minuten in de oplossing te laten voordat primaire en secundaire antilichaamkleuring plaatsvindt. Bovendien moet de BSA-oplossing ook worden gebruikt als verdunningsmiddel voor de primaire en secundaire antilichamen. Afhankelijk van de anti-γ-H2AX en secundaire antilichaam dat wordt gebruikt voor de kleuring, moet men overwegen om verschillende antilichaamverdunningen te testen om de optimale concentratie te bepalen. Voor een nauwkeurigere scoring kan een dubbele kleuring worden uitgevoerd, door extra DNA DSB-reparatie-eiwitantistoffen toe te voegen.

Een groot nadeel van dit type analyse is de noodzaak om zo snel mogelijk na blootstelling bloedmonsters te verkrijgen, omdat bekend is dat het maximale aantal foci binnen 48 uur na de bestraling weer tot normale niveaus afneemt. Daarom kan het nuttig zijn om, wanneer het tijdstip van stralingsongeval en daaropvolgende bloedafname bekend is, te werken met verschillende kalibratiecurven die op verschillende tijdstippen na in vitro bestraling zijn vastgesteld (bijv. 4, 8, 12 en 24 uur). Zoals echter al vermeld in het introductiegedeelte van het manuscript, ligt de kracht van de γ-H2AX foci assay in initiële, snelle triagedoeleinden en moet deze worden gebruikt om prioriteit te geven aan meer tijdrovende cytogenetische biologische dosimetrie. Een gecombineerd scenario waarin meerdere biodosimetriebiomarkers parallel worden gebruikt, zal de meest betrouwbare dosisschatting genereren en verschillende biodosimetrielaboratoria wereldwijd hebben hun krachten gebundeld om landelijke netwerken op te zetten die kunnen worden geactiveerd en gebruikt om meerdere, parallelle biodososimetriebeoordelingen door laboratoria met verschillende expertise mogelijk te maken^37,54,55 . Daarnaast zijn er ontwikkelingen gaande voor supersnelle analyses zoals een mobiel laboratorium op of nabij de plaats van het ongeval^56. Nieuwe, veelbelovende biodosimetriemethoden worden voortdurend ontwikkeld, wat hopelijk zal resulteren in een nog snellere en betrouwbaardere doorvoer in de toekomst⁵⁷.

Voor het geautomatiseerde beeldanalysesysteem worden dia’s ingevoegd of geplaatst op het geautomatiseerde scanplatform of diapodium. Geef daarna de diadetails een naam en sla deze op in de juiste map op de aangesloten computer. Voor dit experiment is de geautomatiseerde detectie van kernen en foci gebaseerd op de respectievelijke classificatie-instellingen. Zorg er bij het maken van een classificator voor dat de geselecteerde classificatorinstellingen overeenkomen met het huidige celtype, de voorbereidingsomstandigheden en de immunofluorescente kleuring van het monster. Geschikte fluorescerende kanalen die overeenkomen met het excitatiespectrum van de primaire en secundaire antilichamen worden ingesteld in de classificator. De classificator maakt het mogelijk om indien nodig aanvullende scoringsparameters in te stellen (bijv. kerngrootte, fluorescerende intensiteit, zoals beschreven in punt 6.1). Als twee of meer DNA-reparatie-eiwitten (bijvoorbeeld γ-H2AX en 53BP1) worden gecombineerd in een experiment, is het systeem ook in staat om co-lokalisaties van signalen te detecteren. Ten eerste verwerft het systeem DAPI-beelden, past beeldverwerking toe en identificeert kernen met behulp van morfologische criteria die in de classificator zijn ingesteld. De TRITC-signalen worden verkregen met behulp van 10 z-stacks met een stapgrootte van 0,35 mm tussen de brandpuntsvlakken⁴⁷. De classificator gebruikte de Direct Foci Count, waarbij het aantal verschillende TRITC-signalen binnen de kern wordt gescoord. Hier is het belangrijk om er rekening mee te houden dat bij toenemende stralingsdosis foci-signalen de neiging hebben om samen te smelten tot grotere objecten, wat resulteert in een onderschatting van het werkelijke foci-aantal als objecten direct worden geteld. Het was niet vereist voor de hier beschreven analyse, maar een extra stap met Corrected Foci Count kan worden geïmplementeerd om dit probleem op te lossen. Met dit laatste kan het systeem de grootte van de gedetecteerde signalen verkrijgen en deze dienovereenkomstig wegen. Het gebruik van beide telmethoden kan een meer realistische schatting geven van het werkelijke aantal foci bij hogere doses.

Om automatisch scannen te beginnen, wordt het scangebied bepaald door het 10x-objectief van de microscoop te gebruiken om een rechthoekig zoekgebied te maken door twee hoeken van het zoekveld te bevestigen met de linkermuisklik (Figuur 5), gevolgd door het scherpstellen van de startpositie. Het referentieobject wordt automatisch geselecteerd en de software vraagt de gebruiker om een referentiekern (met behulp van het 40x-objectief) voor elke dia scherp te stellen en te centreren. Nadat het zoeken is begonnen, gaat het systeem naar het midden van het zoekvenster van de eerste geselecteerde dia en vraagt het om het referentieobject te centreren en scherp te stellen. Dit object zal later worden gebruikt als een positieverwijzing om elke verschuiving in de posities van de cel te corrigeren. Het tweede doel van het referentieveld is de automatische lichtaanpassing, in de doorgelaten lichtmodus wordt het licht aangepast totdat het optimale lichtniveau is bereikt. In de fluorescentiemodus is het lichtniveau vast, maar de integratietijd van de CCD-camera kan worden verhoogd totdat het vereiste signaal is gemeten. Om een correcte lichtinstelling mogelijk te maken, moet de referentie objecten met typische vlekken bevatten. Het is belangrijk om geen veld te gebruiken dat artefacten heeft met een zeer hoge kleurintensiteit. Na de lichtaanpassing start het systeem de raster-autofocus op de rasterpositie die zich het dichtst bij het referentieveld bevindt. Het blijft velden scherpstellen op een regelmatig raster en beweegt in een meander naar de voor- en achterkant van het zoekvenster. Het scannen begint wanneer de raster-autofocus is voltooid. Het werkgebied wordt in een meanderpatroon veld na veld verplaatst om gegevens vast te leggen. Wanneer een cel wordt gedetecteerd, worden de positie en de galerijafbeelding opgeslagen en weergegeven op het scherm en wordt het aantal cellen bijgewerkt. Als er een microscoop-, fase- of feederfout optreedt, wordt de zoekopdracht automatisch geannuleerd. De enige stap waarbij er een handmatige interventie van de operator is, is tijdens het instellen van het scannen van dia’s. Dit is ook het punt waar een snelle kwaliteitscontrole plaatsvindt (luchtbellen, lage celnummers, vervaging van de fluorescerende signaalkleuringsartefacten) en waar kan worden besloten om het scannen van een dia van inferieure kwaliteit af te breken. Een zoekopdracht wordt beëindigd als de hele dia is gescand, als het maximale aantal cellen is bereikt of als de zoekopdracht is geannuleerd. Zodra de scan is voltooid, worden de gegevens gepresenteerd zoals te zien in Figuur 6. Als u gescande cellen wilt weergeven, wordt het venster Galerij geopend en kan elke cel worden bekeken (Figuur 7). Dit is een ander punt waar de operator een kwaliteitscontrole kan uitvoeren door de focus van de galerijafbeeldingen en het totale aantal cellen dat is gescoord te controleren. Als te veel cellen onscherp zijn of als er te weinig cellen door het systeem zijn gedetecteerd om een realistische dosisschatting te maken (bijvoorbeeld 100 cellen in plaats van de beoogde 1000 cellen), moet worden besloten om de dia en de automatische score uit te sluiten van de eindevaluatie. Alle gegevens zijn samengevat in histogrammen (Figuur 8), samen met informatie over de verdeling, de middelen en de standaarddeviatie van fociscores voor elke cel. De histogrammen kunnen ook worden gebruikt om subpopulaties van kernen te selecteren en weer te geven op basis van de geautomatiseerde bevindingen ter beoordeling. Statistische analyses van de resultaten worden uitgevoerd nadat de verdeling, het gemiddelde en de standaarddeviatie van het aantal foci per cel handmatig zijn geregistreerd. De grafiek kan worden gebruikt als een kalibratiecurve voor het maken van een dosisschatting van een biodososimetriemonster. Dit kan worden gedaan met behulp van de vergelijking van de trendlijn om een geschatte schatting te maken van de ontvangen dosis. Bovendien Figuur 9 illustreert dat het geautomatiseerde scannen gevoelig genoeg is om foci geïnduceerd bij lage doses te detecteren. Bovendien tonen de resultaten een duidelijke lineaire toename van het aantal foci per cel met dosis. Opgemerkt moet worden dat de resultaten alleen representatief zijn voor de gebruikte classificator, resultaten zullen verschillen voor verschillende classifierparameters. Daarom is het in het geval van een biodosimetrie-analyse belangrijk dat dezelfde classificator en diapreparaat worden gebruikt voor de biodosimetriemonsters als die welke zijn gebruikt om de kalibratiecurve vast te stellen die wordt gebruikt om de dosisschatting uit te voeren. Hoewel het buiten het bereik van deze studie viel, is het belangrijk op te merken dat de γ-H2AX foci assay ook kan worden gebruikt om gedeeltelijke lichaamsbestralingen te bepalen. De meeste accidentele blootstellingen aan straling zijn inhomogene of gedeeltelijke blootstellingen aan het lichaam, waarbij alleen een gelokaliseerd gebied van het lichaam een hoge dosisblootstelling ontving. Verschillende studies hebben aangetoond dat het mogelijk is om de γ-H2AX foci assay te gebruiken om de fractie van het lichaam die is doorstraald en de dosis voor de doorstraalde fractie te schatten⁴². Wanneer een bestraling van het hele lichaam plaatsvindt, zal er willekeurige inductie van DNA DSB in alle cellen plaatsvinden en kan men een Poisson-verdeling verwachten. Vergelijkbaar met cytogentische methoden waarbij de inductie van chromosomale afwijkingen de neiging heeft om overgedispergeerd te zijn in perifere bloedlymfocyten waar er een grote overvloed aan cellen is met meerdere afwijkingen en cellen met normale metafasen, dispersieanalyse van γ-H2AX-foci met behulp van een verontreinigde Poisson-methode voorgesteld over gedispergeerde foci-verdelingen⁵⁸. Dit laatste werd ook bevestigd in in vivo experimenten met minivarkens en een resusaap⁵⁹.

Materials

Bovine serum albumin – BSA	Merck	A3059
Coplin Jar	Sigma	S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm)	Lasec	Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL)	WhiteSci	607101
Cytospin	Healthcare Technologies	JC370-12-L
Cytospin Clips	Healthcare Technologies	JC302
Cytospin filter cards	Healthcare Technologies	JC307
Cytospin Funnels	Healthcare Technologies	JC372
DAM-TRITC	Invitrogen	A16022
DAPI-Fluroshield	Sigma/Merck	F6057
Ethanol	Kimix	ETD901
Filter tips	WhiteSci	200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl	Merck
Histopaque	Sigma/Merck	10771
lithium–heparin collection tubes	The Scientific Group	367526
MetaSystems – Metafer	Metasystems	Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH	Merck	221465
NovoPen	Leica Biosystems	NCL-PEN
Paraformaldehyde	Sigma/Merck	158127
Phosphate-buffered saline Tablets	Separations	SH30028,02
Pipettes	WhiteSci	P11037 and P1033	X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613402 / 100 μg
RPMI medium	WhiteSci	BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Sigma/Merck	T-9284
Tubes (15ml)	WhiteSci	601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped	SMM Technologies	3800200E