Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).
Abstract
Die potenziellen Funktionen von Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs), die aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind vielversprechend für die Krankheitsmodellierung und Das Screening von Medikamenten. Hier steht eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs zur Verfügung. Die Etablierung einer Endoderm-Linie ist ein wichtiger Schritt bei der Differenzierung zu HLCs. Mit unserer Methode regulieren wir die wichtigsten Signalwege, indem wir Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung kontinuierlich in definitives Endoderm (DE) ergänzen, gefolgt von der Generierung von hepatischen Vorläuferzellen und schließlich HLCs mit typischer Hepatozytenmorphologie in einer stufenweisen Methode mit vollständig definierten Reagenzien. Die mit dieser Methode hergestellten hESC-abgeleiteten HLCs exprimieren stadiumsspezifische Marker (einschließlich Albumin, HNF4α-Kernrezeptor und Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP)) und zeigen besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit reifen und funktionellen Hepatozyten (einschließlich Indocyanin-Grünfärbung, Glykogenspeicherung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und CYP3-Aktivität) und können eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen in der Untersuchung von Lebererkrankungen bieten.
Introduction
Die Leber ist ein stark metabolisches Organ, das mehrere Rollen spielt, einschließlich Desoxidation, Speicherung von Glykogen und Sekretion und Synthese von Proteinen1. Verschiedene Krankheitserreger, Medikamente und Vererbung können pathologische Veränderungen in der Leber verursachen und ihre Funktionen beeinflussen2,3. Hepatozyten als Hauptfunktionseinheit der Leber spielen eine wichtige Rolle bei künstlichen Leberunterstützungssystemen und der Eliminierung der Arzneimitteltoxizität. Die Ressource primärer humaner Hepatozyten ist jedoch sowohl in der zellbasierten Therapie als auch in der Lebererkrankungsforschung begrenzt. Daher ist die Entwicklung neuer Quellen funktioneller menschlicher Hepatozyten eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich der regenerativen Medizin. Seit 1998, als hESCs etabliert wurden4, wurden hESCs von Forschern wegen ihres überlegenen Differenzierungspotenzials (sie können sich in einer geeigneten Umgebung in verschiedene Gewebe differenzieren) und eines hohen Grades an Selbsterneuerbarkeit weithin in Betracht gezogen und bieten somit ideale Quellzellen für biokünstliche Lebern, Hepatozytentransplantation und sogar Lebergewebe-Engineering5.
Derzeit kann die hepatische Differenzierungseffizienz durch Anreicherung des Endoderms6stark erhöht werden. Bei der Liniendifferenzierung von Stammzellen in Endoderm sind ebenen des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalwege und WNT-Signalwege die Schlüsselfaktoren im Knoten des Endodermbildungsstadiums. Die Aktivierung eines hohen TGF-β- und WNT-Signals kann die Entwicklung von Endoderm7,8fördern. Activin A ist ein Zytokin, das zur TGF-β-Superfamilie gehört. Daher wird Activin A häufig in der Endoderminduktion von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und hESCs9,10verwendet. GSK3 ist eine Serin-Threonin-Proteinkinase. Forscher haben herausgefunden, dass CHIR99021, ein spezifischer Inhibitor von GSK3β, typische WNT-Signale stimulieren und unter bestimmten Bedingungen die Stammzelldifferenzierung fördern kann, was darauf hindeutet, dass CHIR99021 das Potenzial hat, die Stammzelldifferenzierung in Endoderm 11,12,13zu induzieren.
Hier berichten wir über eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs effektiv zu induzieren. Die sequentielle Zugabe von Activin A und CHIR99021 erzeugte etwa 89,7±0,8% SOX17 (DE-Marker)-positive Zellen. Nach der weiteren Reifung in vitroexprimierten diese Zellen leberspezifische Marker und übten eine hepatozytenähnliche Morphologie (basierend auf Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)) und Funktionen wie die Aufnahme von Indocyaningrün (ICG), Glykogenspeicherung und CYP3-Aktivität aus. Die Ergebnisse zeigen, dass hESCs mit dieser Methode erfolgreich in reife funktionelle HLCs differenziert werden können und eine Grundlage für leberkrankheitsbezogene Forschung und In-vitro-Wirkstoffscreening bieten können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine schrittweise Methode vor, die HLCs aus hESCs in drei Stufen induziert. In der ersten Stufe wurden Activin A und CHIR99021 verwendet, um hESCs in DE zu unterscheiden. In der zweiten Stufe wurden KO-DMEM und DMSO verwendet, um DE in hepatische Vorläuferzellen zu differenzieren. In der dritten Stufe wurden HZM plus HGF, OSM und Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz verwendet, um die hepatischen Vorläuferzellen weiterhin in HLCs zu differenzieren.
Die folgenden kritisch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 zu X.L.Z.), (Nr. 81571994 zu P.N.S.) unterstützt; die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Nr. 2020A1515010054 bis P.N.S.), Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für nützliche Ratschläge.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
Referenzen
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