Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).
Abstract
Le potenziali funzioni delle cellule simili agli epatociti (HLC) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) promettono molto per la modellazione delle malattie e le applicazioni di screening farmacologico. Ecco un metodo efficiente e riproducibile per la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L’istituzione di un lignaggio endodermo è un passo fondamentale nella differenziazione agli HLC. Con il nostro metodo, regolamentiamo le vie di segnalazione chiave integrando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE), seguita dalla generazione di cellule progenitrici epatiche e infine HHC con morfologia tipica degli epatociti in un metodo scenico con reagenti completamente definiti. Gli HHLC derivati dall’hESC prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del palco (tra cui albumina, Il recettore nucleare HNF4α e il polipeptide cotrasportante taurocorato di sodio (NTCP)) e mostrano caratteristiche speciali relative agli epatociti maturi e funzionali (tra cui colorazione verde indocyanina, stoccaggio di glicogeno, colorazione ematossilina-eosina e attività CYP3) e possono fornire una piattaforma per lo sviluppo di applicazioni basate su HLC nello studio delle malattie epatiche.
Introduction
Il fegato è un organo altamente metabolico che svolge diversi ruoli, tra cui la disossidazione, la conservazione del glicogeno e la secrezione e la sintesi delle proteine1. Vari agenti patogeni, farmaci ed eremita possono causare cambiamenti patologici nel fegato e influenzare le suefunzioni 2,3. Gli epatociti, come principale unità funzionale del fegato, svolgono un ruolo importante nei sistemi di supporto epatico artificiale e nell’eliminazione della tossicità dei farmaci. Tuttavia, la risorsa degli epatociti umani primari è limitata nella terapia a base cellulare, così come nella ricerca sulle malattie del fegato. Pertanto, lo sviluppo di nuove fonti di epatociti umani funzionali è un’importante direzione di ricerca nel campo della medicina rigenerativa. Dal 1998, quando gli hESCsono stati istituiti 4, gli hESC sono stati ampiamente considerati dai ricercatori a causa del loro potenziale di differenziazione superiore (possono differenziarsi in vari tessuti in un ambiente adatto) e dell’alto grado di autorela rinnovabilità, e quindi forniscono cellule di origine ideali per epatici bioartifici, trapianto di epatociti e persino ingegneria del tessutoepatico 5.
Attualmente, l’efficienza di differenziazione epatica può essere notevolmente aumentata arricchendo l’endoderma6. Nella differenziazione del lignaggio delle cellule staminali in endoderma, i livelli del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e le vie di segnalazione WNT sono i fattori chiave nel nodo dello stadio di formazione dell’endoderma. L’attivazione di un alto livello di segnalazione TGF-β e WNT può promuovere lo sviluppo di endoderm7,8. Activin A è una citochina appartenente alla superfamiglia TGF-β. Pertanto, l’attivina A è ampiamente utilizzata nell’induzione endoderma di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) ehESC 9,10. La GSK3 è una proteina chinasi serina-treonina. I ricercatori hanno scoperto che CHIR99021, uno specifico inibitore di GSK3β, può stimolare i tipici segnali WNT e può promuovere la differenziazione delle cellule staminali in determinate condizioni, suggerendo che CHIR99021 ha il potenziale per indurre la differenziazione delle cellule staminali in endoderma 11,12,13.
Qui riferiamo un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L’aggiunta sequenziale di Activin A e CHIR99021 ha prodotto circa 89,7±0,8% cellule SOX17 (marcatore DE)positive. Dopo essere state ulteriormente maturate in vitro, queste cellule hanno espresso marcatori specifici epatici e esercitato morfologia epatocitaria (basata sulla colorazione ematossilina-eosina (H & E)) e funzioni, come l’assorbimento di verde indocyanina (ICG), stoccaggio di glicogeno e attività CYP3. I risultati mostrano che gli hESC possono essere differenziati con successo in HHC funzionali maturi con questo metodo e possono fornire una base per la ricerca correlata alle malattie epatiche e lo screening in vitro dei farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo un metodo graduale che induce gli HLC dagli hESC in tre fasi. Nella prima fase, Activin A e CHIR99021 sono stati utilizzati per differenziare gli hESC in DE. Nel secondo stadio, KO-DMEM e DMSO sono stati usati per differenziare DE in cellule progenitrici epatiche. Nel terzo stadio, HZM più HGF, OSM e sale di sodio idrocortisone 21-emisuccinato sono stati usati per continuare a differenziare le cellule progenitrici epatiche in HHC.
Durante l’utilizzo del protocollo è necessari…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 to X.L.Z.), (n. 81571994 to P.N.S.); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (n. 2020A1515010054 a P.N.S.), La Fondazione Universitaria Li Ka Shing Shantou (n. L1111 dal 2008 al P.N.S.). Desideriamo ringraziare il Prof. Stanley Lin dello Shantou University Medical College per i consigli utili.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
Referenzen
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